Исследование структурно-функциональных свойств люменальных белков PSBO и САН3 фотосистемы 2 растений

• Автор: Калинина, Юлия Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурнофункциональная организация фотосистемы

.2. Белки водоокисляющего комплекса фотосистемы 2.

1.2.1. Белки и высших растений и зеленых водорослей

Структура и взаимодействие с фотосинтетической мембраной.

Функция.

1.2.2. Белки и V красных водорослей, цианобактерий

и зеленых оксифотобактерий

Структура и взаимодействие с фотосинтетической мембраной

Функция.
1.2.3. Белки цианобактерий, гомологичные и эукариот
1.2.4. Белок красных водорослей, гомологичный эукариот
1.3. Белок .
1.3.1. Структура
Первичная структура белка.
Структура , связанного с фотосистемой 2.
Структура в растворе.
Дисупьфидиая связь
Кислотнощелочной гистерезис буферных свойств белка.
1.3.2. Взаимодействие с фотосинтетической мембраной.
1.3.3. Функция
Эффекты, возникающие в отсутствие
Гипотезы о функциональном значении .
1.4. Карбоангидразная активность, ассоциированная с фотосистемой 2.
1.5. Карбоангидраза СаЬЗ одноклеточной зеленой водоросли
ii.
1.5.1. Внутриклеточная локализация.
1.5.2. Функциональное значение
1.6. Рсдоксрегуляция фотосинтетических процессов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Экспрессия в ii i, выделение
и очистка рекомбинантного белка
2.1.1. Конструирование плазмид для экспрессии .
2.1.2. Экспрессия рекомбинантных белков
2.1.3. Выделение и очистка слитных белков xi и xi6X.
2.1.4. Разделение слитного белка xI Ii.
2.1.5. Разделение слитного белка xiX
2.2. Сайтнаправленный мутагенез
2.3. Экспрессия СаЬЗ в ii i, выделение
и очистка рекомбинантного белка.
2.3.1. Конструирование экспрессионного вектора.
2.3.2. Экспрессия и очистка СаЬЗ.
2.4. Получение препаратов ФС 2 из листьев шпината,
выделение и очистка шпината.
2.5. Реконструкция ФС 2 с помощью рекомбинантного
2.6. Получение препаратов ФС 2 из клеток С. iii.
2.7. Реконструкция препаратов ФС 2 из мутанта С. iii i
с рекомбинантной карбоангидразой саЬЗ
2.8. Исследование взаимодействия ионов Са2 и Мп2 с методом
температурной зависимости собственной флуоресценции белка.
2.9. Исследование взаимодействия ионов Са2 и Мп2 с и индуцируемых конформационных переходов
методом флуоресценции гидрофобного зонда АНС
2 Температурная и солевая обработка 2 препаратов
на свету и в темноте.
2 Электрофорез в градиенте мочевины
2 Расчет плотности межмолекулярных контактов в молекуле .
2 Электрофорез и иммуноблоттинг
2 Определение концентрации белка.
2 Определение концентрации хлорофилла
2 Определение карбоангидразной активности
2 концевос ссквенирование и массспектрометрия.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Экспрессия шпинатного в ii i, разработка методики выделения и очистки рекомбинантного белка.
3.1.1. Экспрессия в векторных плазмидах рЕТ и рЕГ.
3.1.2. Выделение и очистка рекомбинантного ,
экспрессированного в векторной системе рЕТ
3.1.3. Замена последовательности сайта узнавания энтерокиназы в экспрессионном векторе на последовательность
сайта узнавания фактора Ха
3.1.4. Экспрессия в векторной плазмиде X,
выделение и очистка рекомбинантного белка.
3.1.5. Исследование структурнофункциональных свойств
рекомбинантного
3.2. Экспрессия карбоангидразы СаЬЗ в ii i, разработка
методики выделения и очистки рекомбинантного белка
3.3. Изучение влияния на конформацию i vi и на
способность белка взаимодействовать с ионами кальция и марганца.
3.3.1. Исследование взаимодействия ионов кальция и марганца с
методом температурной зависимости собственной флуоресценции белка.
3.3.2. Исследование взаимодействия ионов кальция и марганца с и рНипдуцируемых конформаиионных переходов
с использованием гидрофобного красителя АНС
3.4. Влияние освещения на экстракцию и
ионов марганца из препаратов ФС 2.
3.5. Сайтнаправленный мутагенез аминокислотных остатков , предположительно ответственных за
индуцируемые конформациоиные изменения белка.
3.6. Реконструкция препаратов ФС 2 из мутанта С. iii i
с рекомбинантной карбоангидразой СаЬЗ.
3.6.1. Влияние рекомбинантной карбоангидразы СаЬЗ на скорость
выделения кислорода у препаратов ФС 2 из мутанта i3.
3.6.2. Влияние рекомбинан тной карбоангидразы СаЬЗ на фотоиндуцируемые изменения выхода флуоресценции
хлорофилла ФС 2 мутанта i
3.6.3. Связывание СаЬЗ с комплексами ФС 2 из мутанта.
3.7. Исследование влияния окислителей и восстановителей сульфгидрильных групп на структуру и функцию
белков СаЬЗ и
3.7.1. Влияние окислителей и восстановителей сульфгидрильных
групп на активность СаЬЗ
3.7.2. Влияние дисульфидной связи на стабильность структуры
3.8. Заключение белки и СаЬЗ как необходимые компоненты водоокисляющего комплекса фотосистемы 2.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


После захвата двух электронов и двух протонов диссоциирует в липидную фазу. Окисленный Рд восстанавливается за счет тирозинового остатка Д1 белка. Окисление воды с переносом электронов на Рд осуществляется в водоокисляющем комплексе ВОК, расположенном на люменальной стороне ФС 2. ВОК представлен марганцевым кластером и рядом водорастворимых белков. Белковый состав водоокисляющих комплексов разных организмов различен, исключение составляет белок, который присутствует у всех оксигенных фотосинтезирующих организмов. Кроме того, в белковое окружение марганцевого кластера вносят вклад люмеиальные домены СР и СР белков. Марганцевый кластер состоит из четырех атомов марганца и одного атома кальции, лигандами для которых служат определенные аминокислотные остатки белков Д1 и СР. Фундаментальная модель механизма фотосинтетического окисления воды, предложенная Жолио с соавт. ВОК последовательно окисляется, проходя через 5 промежуточных состояний, известных как состояния п 0 4, для того чтобы накопить энергию окислительных эквивалентов, необходимых для окисления двух молекул НгО. Считается, что происходит четырехэлектроннос окисление воды за счет накопления четырех окислительных эквивалентов ионами марганца. В результате окисления двух молекул воды ВОК возвращается в исходное состояние, затем, в результате фотохимических реакций, происходящих в РЦ, цикл повторяется. Рис. Схема расположения основных компонентов пигментбелкового комплекса фотосистемы 2 высших растений. Д1 РбЬА и Д2 РбЬЭ белки с мол. Да СР и СР прочно связанные с РЦ светособирающие комплексы РзЬО, РэЬР и РяЬС водорастворимые белки системы окисления воды Су1 Ь9 цитохром Ь9 , имеющий максимум поглощения при 9 нм Рбво димер хлорофилла, первичный донор электрона РЬео молекула феофитина, первичный акцептор электрона Ол и Он первичный и вторичный хиноновые акцепторы электрона пул пластохинона Ту г г вторичный донор электрона Туг1 белка Д1. В левом нижнем углу показана схема циклического перехода системы окисления воды в различные окислительновосстановительные состояния 8псрсходы. Водоокисляющий комплекс ФС 2 у высших растений и зеленых водорослей представлен белками кДа, кДа и кДа, у красных водорослей, цианобактерий и зеленых оксифотобактерий белками , кДа и V цитохром с0. Кроме того, сейчас уже общепринято, что в состав ВОК цианобактерий входят также белки, гомологичные белкам и высших растений . ВОК входит белок с мол. Да, гомологичный высших растений . Кроме того, показано, что у одноклеточной зеленой водоросли iii на люменальной стороне ФС 2 ассоциирована карбоангидраза СаЬЗ, относящаяся к атипу карбоангидраз . Vi . Присутствие 3 необходимо для оптимального функционирования ВОК С. Vi . Хотя наличие данного белка в составе ФС 2 доказано только для одного организма, многочисленные данные свидетельствуют о существовании карбоангидразной активности, ассоциированной с ФС 2, у других фотосинтезирующих организмов Комарова с соавт. Пронина с соавт. Функция внешних белков ВОК заключается в стабилизации и оптимизации работы каталитического центра, осуществляющего фотосинтетивеское окисление воды, при этом белок имеет ключевое значение. ВОК, который встречается у всех оксигенных организмов. Аноксигенные фотосинтезирующие бактерии не содержат белков аналогичных iv . На основе анализа филогенетического древа фотосинтезирующих организмов было высказано предположение, что появился одновременно с возникновением способности к фотоокислению воды, и у первых оксигенных организмов он был единственным белковым компонентом ВОК. Впоследствии ВОК был дополнен белками , V и белком, гомологичным , как это имеет место у примитивной цианобактерии vi, а затем и белком, гомологичным современные цианобактерии. Возникновение эукариотических фотосинтетиков зеленых водорослей и высших растений сопровождалось потерей белков и V iv . Таким образом, в ходе эволюции белковый состав ВОК претерпел существенные изменения, что вероятно явилось следствием необходимости оптимизировать функцию окисления воды в различных экологических условиях iv .