Исследование механизма Са2+-миристоильного переключателя на примере фоторецепторного Са2+-связывающего белка рековерина

• Автор: Комолов, Константин Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Ионы кальция и регуляция зрительной трансдукции

1. Общая схема зрительной трансдукции

1.1. Передача зрительного сигнала.

1.2. Восстановление темнового состояния фоторецепторной клетки

2. Молекулярные механизмы Сазависимой регуляции зрительной трансдукции.

2.1. Светозависимое изменение Са2г в НСП катионные каналы и МаК, Са2обменник.

2.2. Са2 и гуанилатциклаза.

2.3. Са2 и аденилатциклаза.

2.4. Са и родопсинкиназа

2.4.1. Фосфорилирование фотовозбужденного родопсина.
2.4.2. Фосфорилирование темнового родопсина.
3. Белки семейства нейрональных Са сенсоров
3.1. Общая характеристика семейства нейрональных Са2сенсоров. .
3.2. Рековерин
3.2.1. Тканевая и клеточная локализация.
3.2.2. Ген и первичная структура
3.2.3. Ыконцевое ацилирование
3.2.4. Са2связывающие центры рековерина.
3.2.5. Пространственная структура и модель Са миристоильного переключателя рековерина
3.3. всАРбелки ССАР1 и ОСАР
3.4. Визининподобные белки нейрокальцин
3.5. Фреквенины 1 и фреквенин 1.
3.6. КСЫРбелки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Реактивы
2. Выделение НСП.
3. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран.
4. Получение рекомбинантного миристошшрованного и немиристоилированного рековерина.
5. Очистка препарата миристошшрованного рековерина от примеси немиристоилированного
6. Приготовление кальциевых буферов и измерение Са2г
7. Определение количества кальция, связанною с рековерином.
8. Взаимодействие рековерина с фенилсефарозой
9. Выделение родопсинкиназы
. Определение активности родопсинкиназы
. Связывание рековерина с отмытыми мочевиной
фоторецепторными мембранами
. ЬРЯспектроскопия
.1. Приготовление липосом
.2. Иммобилизация липосом
.3. Измерение связывания рековерина с ЗРЛчипом и обработка экспериментальных данных.
. Аналитические процедуры
.1. Определение концентрации белков
.2. БЭБэлектрофорез в полиакриламидном геле ПААГ
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Исследование механизма связывания ионов кальция с рековерином
2. Изучение роли Са2связывающих центров рековерина в
функционировании его Са2миристоильного переключателя.
2.1. Кальцийзависимое экспонирование гидрофобного кармана рековерина.
2.2. Кальцийзависимое ингибирование родопсинкиназы реко верином
2.3. Кальцийзависимое экспонирование миристоильного остатка
рековерина
3. Исследование взаимодействия рековерина дикого типа и его мутантов по капьцийсвязывающим центрам с иммобилизованным липидным бислоем методом ЗРспектроскопии.
3.1. Характеристика метода ЗРЯспектроскопии применительно к связыванию рековерина с липидным бислоем, иммобилизованным на ЗРчипе.
3.2. Определение сродства миристоилированных форм иТрековерииа и мутанта КсЕ5 к липидному бислою, иммобилизованному на ЗРЯчипе
3.3. Исследование кальцийзависимого экспонирования миристоильного остатка рековерина методом ЗРспектроскопии. .
3.4. Кинетика диссоциации миристоилированных форм идрековерина и мутанта сЕ из комплекса с липидным бислоем,
иммобилизованным на ЗРЯчипе.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Концевое миристоилирование выявлено не только у рековерина, но и почти у всех остальных членов семейства нейрональных Са2сенсоров, что свидетельствует о
важности Са миристоильного переключателя для функционирования
белков этого семейства. Изучению механизма Са миристоильного переключателя на примере рековерина и посвящена настоящая работа. Общая схема зрительной трансдукции. Сенсорную функцию в сетчатке фоточувствительном слое глаза выполняют фоторецепторные клетки палочки и колбочки, представляющие собой высокоспециализированные нейроны. Палочек в сетчатке млекопитающих, в том числе человека, примерно 0 миллионов на одну сетчатку, причем расположены они преимущественно по периферии ее зрительной части колбочки их около 7 миллионов на сетчатку концентрируются в центральной ее зоне. Палочки отвечают за сумеречное зрение при низкой освещенности, которое имеет малую разрешающую способность, и преобладают у животных, ведущих ночной образ жизни. Колбочки эффективно работают при достаточно ярком освещении и обеспечивают цветное зрение соответственно, их больше у животных, активных преимущественно днем 1, 2. Оба типа фоторецепторов это длинные, узкие клетки, свое название они получили изза формы их наружных сегментов, которые у палочек тонкие, цилиндрические, у колбочек значительно более утолщенные рис. Наружный сегмент часть фоторецепторной клетки, которая своим окончанием обращена к наружи глаза. В наружном сегменте присутствуют зрительный пигмент и катаболическис ферменты, необходимые этой структуре для выполнения функции световой антенны 1,2, 3. Наружный сегмент палочки НСП в онтогенезе развивается из цилии и представляет собой стопку из сотен или даже тысяч так называемых фоторецепторных дисков. Позднее диски как бы отпочковываются от плазматической мембраны, превращаясь в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от нее, так и друг от друга. Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет ведет свое происхождение от внеклеточного пространства 1,2. Наружные сегменты колбочек принципиально отличаются от НСП тем, что колбочковые диски представляют собой складки плазматической мембраны и их внутриклеточное пространство сообщается с внеклеточной средой. Рис. Схемы строения сетчатки позвоночных А и отдельной палочки Б. На диски приходится подавляющая часть массы НСП, в то время как на плазматическую мембрану всего 4, 5. Около общего белка НСП составляет интегральный мембранный белок родопсин 6. Только два белка присутствуют в количестве, превышающем 1 копию на 0 молекул родопсина, это трансдуцин и аррестин. Еще белков, включая фосфодиэстеразу, представлены 1 копиями на молекул родопсина. Молярное соотношение фосфодиэстераза трансдуцин родопсин выглядит как 1 0 7. Передача зрительного сигнала. Свет, воздействуя на зрительный пигмент родопсин, переводит его в фотовозбужденное состояние , и далее сигнал передатся от к зависимым катионным каналам, локализованным в плазматической мембране фоторецепторной клетки. Передача сигнала от к катионным каналам опосредуется фосфодиэсгеразным каскадом, последовательность событий в котором имеет следующий вид светозависимая активация родопсина обмен на трансдуцине активация фосфодиэстеразы падение внутриклеточной концентрации фоторецепторного вторичного мессенжера закрывание катионных каналов и гиперполяризация плазматической мембраны НСП рис. Далее зрительный сигнал передается через нейроны высшего порядка и по зрительному нерву в соответствующие отделы головного мозга 1, 2. Рис. Общая схема молекулярных механизмов зрительной трансдукции. Я и К соответственно, темновой и фотовозбужднный родопсин Т трансдуцин РОЕ сСМРфосфодиэстераза ЩС родопсинкиназа Лг аррестин вС гуанилатциклаза. Светочувствительный белок родопсин первый участник фосфодиэстеразного каскада представляет собой гликопротеид с молекулярной массой около кД, который состоит из 8 аминокислотных остатков 8 и хромофорной группы, 1исретиналя 9. СТРсСМР сСМРСМР
СОПЛ г , Са.