Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis

• Автор: Портнягина, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 96 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Порообразующие белки наружной мембраны НМ и их биологические свойства

1.1. Структура и функции НМ грамотрицательных бактерий 5

1.2. Основные белки НМ грамотрицательных бактерий 7

1.3. Структура и функциональные особенности порообразующих белков

1.4. Биологические свойства порообразующих белков НМ грамотрицательных бактерий

1.4.1. Антигенная характеристика белков НМ грамотрицательных бактерий 1.4.1 Л. Антигенные детерминанты белков

1.4.1.2. Структура антигенных детерминант поринов

1.4.2. Иммуногенные свойства поринов

1.4.3. Порины как протективные антигены
1.4.4. Протективные свойства антител к поринам
1.4.5. Другие виды биологической активности поринов
1.4.6. Взаимодействие поринов с антибиотиками
1.5. Иммунодиагностика псевдотуберкулеза
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. Материалы и методы исследования
2.1. Выделение порообразующего белка из НМ У. i
2.1.1. Культивирование клеток У. i
2.1.2. Первичная обработка биомассы клеток
2.1.3. Получение порообразующего белка
2.2. Физикохимические методы
2.3. Аналитические методы
2.4. Иммунологические методы
2.4.1. Получение антисывороток
2.4.2. Получение сывороток крови
2.4.3. Иммуноферментный анализ ИФА
2.4.4. Реакция связывания антигена со специфической антисывороткой
в ИФА
2.4.5. Иммуноблоттинг
2.5. Биологические методы
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3. Иммунобиологические свойства порообразующего белка НМ ii i
3.1. Выделение и характеристика белкапорина из НМ . i
3.1.1. Иерсинин основной белок НМ . i
3.1.2. Получение иерсинина и его физикохимическая характеристика
3.2. Иммунохимические свойства иерсинина
3.2.1. Иммуногенные свойства иерсинина
3.2.2. Антигенная структура молекулярных форм тримера и мономера иерсинина
3.2.3. Динамика иммунного ответа на различные молекулярные формы иерсинина
3.2.4. Иерсинин видо и родоспецифический антиген рода ii
3.2.5. Протсктивные свойства иерсинина
3.2.6. Участие иерсинина в патогенезе псевдотуберкулеза
4. Тестсистема для диагностики исевдотуберкулеза
5. Новый способ получения иерсинина
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Клеточная оболочка грамотрицательных бактериий образована двумя мембранами, наружной и внутренней цитоплазматической, разделенными между собой слоем пептидогликана ПГ и периплазматическим пространством , V , . Мембраны связаны между собой зонами адгезии. В клетке существует 00 таких зон, на их долю приходится до клеточной поверхности Вауег, . В состав изолированной НМ входят белки, фосфолипиды, липопротеин и липополисахарид ЛПС. В зависимости от прочности связи с мембраной белки относят к периферическим или интегральным. Периферические белки связаны с мембраной за счет полярных и ионных взаимодействий и относительно легко отделяются от нее в мягких условиях. Интегральные белки имеют на своей поверхности большие гидрофобные участки и располагаются внутри мембраны. Некоторые мембранные интегральные белки специфически взаимодействуют с ПГ и образуют группу так называемых белков, ассоциированных с ПГ , V , . В НМ существует множество пор, образованных специальным классом белков, так называемыми поринами, которые относятся к доминирующим в количественном отношении мембранным белкам. Через пориновые каналы способны диффундировать гидрофильные вещества с молекулярной массой 67 кДа, участвующие в метаболизме бактерий и вступающие во взаимодействие со специфическими транспортными системами, расположенными в цитоплазматической мембране . Количество и тип поринов, так же как и соотношение компонентов НМ, может определяться особенностями данного штамма и условиями культивирования данного микроорганизма , V , . Количество фосфолипидов в НМ заметно меньше, чем в цитоплазматической в основном это фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин кардиолипин. ЛПС специфический биополимер, характерный для грамотрицательных бактерий, занимает около ее поверхности. Согласно современным представлениям ii, , ЛПС представляет собой семейство структурно и функционально родственных амфифильных макромолекул, которые состоят из Оспецифического полисахарида, определяющего антигенную специфичность данного вида бактерий, олигосахарида кора и липидного фрагмента, так называемого липида А. Липидный компонент ЛПС является наиболее консервативным участком молекулы. ЛПС, обеспечивая стабильность мембраны. ЛПС известен как эндотоксин патогенных грамотрицателъных бактерий. Данные ультраструктурных и биохимических исследований свидетельствуют о высокой степени асимметрии НМ бактерий ЛПС и белки находятся на внешней ее стороне, а фосфолипиды локализованы во внутренней области мембранного бислоя , , . Через липопротеин НМ нековалентно связана с ПГ. Сложное строение НМ грамотрицателъных бактерий обусловлено условиями их обитания. Чаще всего это гипотоническое окружение, способное вызвать лизис цитоплазматической мембраны. Бактерии сем. i, например, обитают в кишечнике человека, и НМ защищает цитоплазматическую мембрану от детергентподобного действия желчных солей, жирных кислот, глицеридов, протеолитических и липолитических ферментов, гликозидов i, . Благодаря наличию пор, НМ является эффективным барьером, препятствующим проникновению в клетку макромолекул и гидрофобных веществ. В результате обеспечивается устойчивость клетки по отношению к защитным факторам макроорганизма, таким как лизоцим, бетализин, катионные белки лейкоцитов . . На долю белков приходится до половины от массы клеточной оболочки бактерии, большинство из них локализовано в i, i, . В состав НМ грамотрицательных бактерий входят белки, отличающиеся по свойствам от интегральных белков цитоплазматической мембраны. Поскольку для извлечения этих белков обычно необходимы ионные детергенты , или сочетание неионных тритона Х0, саркозила с ЭДТА i, , можно сказать, что в их стабилизации в мембране, наряду с гидрофобными, важную роль играют ионные взаимодействия. Применение эффективных и чувствительных методов анализа показало, что мембрана содержит достаточно большой набор белков i, . Среди них преобладают несколько гак называемых основных белков, т.