Изучение влияния Т-кадгерина на проницаемость эндотелиального монослоя, организацию цитоскелета и системы внутриклеточной сигнализации

• Автор: Семина, Екатерина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 153 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Суперсемейство кадгеринов

1.2 Классические кадгерины. Структура калгсринового комплекса

1.3 Кадгерины в клетках сосудов

1.4 Механизмы регуляции проницаемости эндотелия

1.5 Регуляция кадгеринопосредуемой межклеточной адгезии путем фосфорилирования

1.6 Влияние кадгеринового комплекса на активацию внутриклеточных сиг нальных путей

1.7 Ткадгерин опосредует внутриклеточную сигнализацию

1.8 Роль Ткадгсрина в сосудистой системе в норме и при патологии
1.9 Ткадгерин регулирует пролиферацию клеток и опухолевый рост
1. Ткадгерин опосредуег сигнальные эффекты ЛИП в клетках сосудов
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.2 Культивирование эукариотических клеток
2.3 Трансфекция эукариотических клеток и селекция клонов
2.4 риготовление лизатов клеток
2.5 Определение концентрации белка в лизатах клеток
2.6 Электрофорез белков и иммуноблотгинг
2.7 Метод измерения активности
2.8 Метод выделения активных ГТФаз
2.9 Иммунофлуоресцентнос окрашивание эндотелиальных клеток
2. Гиперэкспрессия Ткадгерина в ЭК с использованием аденовирусной трансдукции
2. Подавление нативной экспрессии Ткадгерина в ЭК методом i
с использованием лентивирусной трансдукции
2. Метод измерения проницаемости эндотелиального монослоя i vi
2. Метод экстракции актина
2. Выделение и йодирование ЛИП
2. Определение поверхностного связывания ЛН с клетками
2. Определение концентрации внутриклеточного Са2
2. Миграция 9 клеток в микрокамере Нойдена
2. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Ткадгерин активирует ГТФазы
3.2 Ткадгерин активирует и , но не влияет на активность
3.3 Ткадгерин увеличивает содержание фосфорилированной I1 и влияет на организацию микротрубочек в ЭК
3.4 Гиперэкспрессия Ткадгерина увеличивает содержание стресс фибрилл актина
3.5 Подавление экспрессии Ткадгерина уменьшает содержание стресс фибрилл
актина в ЭК
3.6 Ткадгерин изменяет экспрессию ркатенина, но не Vкадгерина
3.7 Подавление экспрессии Ткадгерина уменьшает проницаемость эндотелиального монослоя
3.8 Получение клонов клеток, гиперэкспрессирующих Ткадгерин. Анализ экспрессии
Ткадгерина в клонах
3.9 Гиперэкспрессия Ткадгерина увеличивает связывание 1ЛНП с мембранами
клеток Г9 и НЕК3
3. Введение ЛНП вереду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих
Ткадгерин, повышает концентрацию внутри клеточного кальция
3. ЛНП стимулируют миграцию клеток, гиперэкспрессирующих Ткадгерин
Г ЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Локализация Ткадгерина на конусе роста прорастающих к своим мишеням аксонов мотонейронов . Ткадгерина в прорастании мелких сосудов и капилляров при неоангиогенезе и опухолевом ангиогенезе . i . Ткадгсрина на лидирующем крае мигрирующих эндотелиальных клеток Ivv . Ткадгерин является навигационным рецептором, участвующим в активации систем внутриклеточной сигнализации. В литературе имеются отдельные данные, подтвержадющие это предположение в модельных экспериментах на культуре клеток i vi было показано, что взаимодействие между молекулами Ткадгерина на поверхности эндотелиальных клеток приводит к активации и сигнальных путей, изменению организации актинового цитоскслста и смене клеточного фенотипа с нормального на промиграторный iiv . iiv . Кроме того, способность эндотелиальных клеток, гиперэкспрессирующих Ткадгерин, прикрепляться и распластывай,ся на субстрате, содержащем рекомбинантный Ткадгерин, достоверно снижается по сравнению с контролем iiv . Тем не менее, следует отмстить, что подавление активности и сигнальных путей лишь частично снимает Ткадгеринзависимые изменения клеточного фенотипа, что позволяет предполагать осущсствованис дополнительных путей передачи сигнала с Ткадгерина внутрь клетки. Таким образом, целью данной работы было оценить влияние экспрессии Ткадгерина на активацию систем внутриклеточной сигнализации, реорганизацию компонентов цитоскелета и проницаемость эндотелиального монослоя. Активацию внутриклеточной сигнализации с участием ГГФаз и реорганизацию цитоскелега. Проницаемость эндотелиального монослоя. Экспрессию и локализацию Vкадгерина и Связывание 1ЛНП с поверхностью клеток. Изменение концентрации внутриклеточного кальция в ответ на добавление III в среду инкубирования. Миг рацию клеток по градиенту ЛНГ1. ГЛАВА I. На основании происхождения, а также в соответствии с доменной и геномной организацией, суперсемейство кадгеринов делится на 5 больших групп . i, Vi . i, Рис. I. Тип 1. Кадгерины этого типа содержат 57 внеклеточных доменов, трансмембранную и цитоплазматическую часть. В составе аминотерминального . 1 домена есть аминокислотная последовательность iV V, необходимая для гомофильного узнавания кадгерины Е, , Р, , В, К, С, ХВ, Е, кадгерин дрозофилы и кадгсрин. Эти кадгерины внутриклегочной частью вади моде йству ют с iкатенином, акатенином, белком р 0 и актиновым цитоскелетом. Тип . Кадерины этого типа также участвуют в гомофильной адгезии, но не содержат последовательности V кадгерины V, ОВ, и кадгерины 6, 7, 8, , , . Кадгерины II типа сосредоточены в мссгах адгезивных межклеточных контактов, где их внутриклеточный домен также взаимодействует с актиновым цитоскелетом посредством катенинов. Десмосомальныс кадгерины десмоколлины, десмоглеины. Кадгерины этой группы формируют десмосомальные контакты, цитоплазматический домен которых взаимодействует с плакоглобином укатенином, десмоилакином и промежуточными филаментами. Атипичные калгерины Ткадгерин, кадгерин. Кадгерины, не содержащие внутриклеточного и цитоплазматического доменов, и не взаимодействующие с катенинами и актиновым цитоскелетом. Протокадгерины кадгерины апротокадгерины, РАРС и АХРС. Имеют различные по строениею внеклеточные домены. Протокадгерины экспрессируются преимущественно в нервной системе, и цитоплазматической частью не связаны с катенинами. Кадгериноподобные сигнальные белки , , i, тирозинкиназа. Белки имеют характерную для кадгеринов доменную организацию. Играют важную роль в эмбриогенезе, участвуют в подавлении роста опухолей, формировании полярности в основном в эмбриогенезе у i. О функции этих белков мало что известно. Рисунок . Суперсемейство кадгеринов. А Классические кадгерины. Б Протокадгерины. В Атипичные кадгерины. Г Десмосомальные кадгерины. ДКадгериноподобные белки.