Изучение биосинтеза сывороточных белков в бесклеточных системах

• Автор: Тимченко, Любовь Тимофеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 187 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Церулоплазмин и трансферрин металлопротеиды

плазмы крови

1.1. Структура и функции церулоплазмина .

1.2. Биосинтез церулоплазмина.

1.3. Строение трансферрина

1.4. Биологическая роль трансферрина.

1.5. Биосинтез трансферрина

Глава 2. Биосинтез, внутриклеточный транспорт и

процессинг секреторных белков .
2.1. Топография синтеза секреторных белков .
2.2. Транспорт белков через мембраны .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Выделение полирибосом из печени крысы
3.2. Выделение суммарной полирибосомной РНК из
печени крыоы .
3.3. Выделение суммарной высокомолекулярной РНК
из цитоплазмы печени крысы.
3.4. Получение фракций РНК, обогащенных последовательностями мРНК церулоплазмина и трансферрина .
3.5. Выделение ноли Асодержащей РНК
3.6. Получение экстракта из зародышей пшеницы . .
3.7. Трансляция РНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.
3.8.1. Получение лизата ретикуловдтов кролика .
3.8,2г Обработка лизата ретикулоцитов кролика
микрококковой нуклеазой
3.9. Трансляция РНК в лизате ретикулоцитов
кролика
З.Ю. Выделение клеточного сока из печени крысы
3 Трансляция полирибосом из печени крысы в
реконструированной системе полирибосомы клеточный сок
3 Иммунопреципитация продуктов трансляции
3 Электрофорез радиоактивных белков
31. Электрофорез в трубках
32. Электрофорез в пластинчатом полиакриламидном
I
3 Радиоавтография и флюография полиакриламидных
гелей.
31. Выделение микросом.
32. Выделение фракции аппарата Гольдаи
Глава 4. Общая характеристика бесклеточных систем
трансляции
4.1. Характеристика системы синтеза белка из
зародышей пшеницы .
4.2. Характеристика реконструированной системы полирибосомы клеточный сок из печени
крысы .
4.3. Характеристика лизата из ретикулоцитов
кролика как бесклеточной системы трансляции мРНК.
Глава 5. Биосинтез церулоплазмина в бесклеточных
системах
5.1. Биосинтез церулоплазмина в бесклеточной
системе из зародышей пшеницы
5.2 Биосинтез церулоплазмина в реконструированной
системе полирибосомы клеточный сок
5.3. Биосинтез церулоплазмина в лизате из
ретикулоцитов кролика .
Глава 6. Биосинтез трансферрина в бесклеточных
системах .
6.1. Биосинтез трансферрина в бесклеточной
системе из зародышей пшеницы
6.2. Биосинтез трансферрина в реконструированной системе полирибосомы клеточный сок
6.3. Биосинтез трансферрина в лизате ретикулоцитов кролика.
Глава 7, Биосинтез и посттрансляционное созревание
трансферрина в субклеточных фракциях печени крысы.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Ген Москва, АМН СССР, г. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I. Церулоплазмин ЦП является медьсодержащим гликопротеидом компонентом оС,глобулиновой фракции белков плазмы крови. На долю ЦП приходится около меди, циркулирующей в кровотоке позвоночных животных. ЦП является гликопротеидом. В его молекуле содержатся 4 олигосахаридные цепи, на долю которых приходится около общей массы молекулы белка. В составе углеводных цепей ЦП найдены остатки ацетилглюкозамина, фукозы, маннозы, сиаловой кислоты 4. В настоящее время общепринято, что молекула ЦП состоит из единственной ковалентно непрерывной полипептидной цепи, которая имеет молекулярную массу около 0 к Однако, в течение ряда лет в литературе обсуждался вопрос о четвертичной структуре ЦП и приводились данные о том, что молекула этого белка содержит несколько 2,4,8 и т. Причины этих противоречий связаны с крайне высокой чувствительностью ЦП к протеазам, расщепляющим протяженную полипептидную цепь ЦП на ряд дискретных фрагментов в процессе выделения ЦП стандартными методами. Д и на минорные компоненты 2 и кД 9. При электрофорезе денатурированного ЦП, изолированного стандартным методом без применения ингибиторов протеолиза, наблюдается снижение относительного содержания 0 кДполипептида до его полного исчезновения и появляются дополнительные полипептидные зоны 0, и кД 9. При хранении вццеленных препаратов ЦП без ингибиторов протеаз наблюдается снижение относительного содержания полипептидов с молекулярными массами 0, 2, 0, и кД с нарастанием доли низкомолекулярного кДкомпонента 6. На основании этих результатов был сделан вывод, что молекула ЦП содержит пять пептидных связей, характеризующихся очень высокой чувствительностью к действию протеаз. Принципиально сходные результаты были получены в работе i и др. ЦП человека имеются две пептидные связи, легко расщепляемые в условиях ограниченного трипсинолиза. При этом образуются протеолитические фрагменты ЦП с молекулярными массами , и кД. ПН2 иД кД КДСН При дальнейшем трипсинолизе ЦП происходило расщепление кДфрагмента на два субфрагмента с молекулярными массами кД и кД, а кДфрагмент ЦП расщеплялся с образованием кД и кДсубфрагментов. Аналогичная картина протеолитической фрагментации ЦП была получена в работах Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР 9. В серии недавних работ лаборатории 0 была определена почти полная последовательность аминокислот ЦП человека, При анализе первичной структуры этого белка обнаружена существенная внутримолекулярная гомология, причем выявлены 3 гомологичные зоны степень гомологии между ними . На основании этих результатов, а также изучения характера протеолитической фрагментации ЦП и распределения 4х олигосахаридных цепей в молекуле ЦП была предложена модель структуры молекулы ЦП 0, Согласно этой модели молекула ЦП состоит из 3х гомологичных доменов, каждый из которых может быть разделен на два неидентичных субдомена. Общее количество доменов 6 рис. Возможно, также, что полипептидная цепь ЦП состоит из 9 доменов трех видов. Содержание меди в ЦП составляет 6 атомов на I молекулу белка. По своим спектральным характеристикам атомы меди, связанные с ЦП относятся к трем различным типам 0. В литературе нет единого мнения относительно физиологической функции ЦП, однако имеющийся фактический материал позволяет предполагать, что ЦП является полифункциональным белком, который обладает каталитической активностью и специфическими медьтранспортными функциями I. Прежде всего, ЦП имеет оксидазную активность в опытах п vi и окисляет большое количество субстратов ионы Ре2 , аскорбиновая кислота, ароматические амины и фенолы и др. Повидимому, оксидазная активность ЦП реализуется и в организме и играет существенную роль в окислении таких физиологических субстратов как ионы 2, аскорбиновая кислота, биогенные амины адреналин, 5окситриптамин. НИ А, Аг В А Аг В АА Рис. Буквами АВ обозначены домены. Чоксидоредуктаза или ферроксидаза КФ .