Жирнокислотный профиль и структурное моделирование ДНК-связанных липидов

• Автор: Шмырина, Анастасия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

Введение

Общая характеристика работы

Глава 1. ДНКсвязанные липиды хроматина и методы их исследования обзор литературы

1.1. Липидомика и липиды хроматина

1.2. Выделение общих липидов

1.3. ДНК связанные липиды и методы их выделения

1.4. Организация бактериальной ДНК

1.5. Структурная и функциональная роль липидов в организации ДНК, хромосом и хроматина

1.6. Принципы хроматомассспектроскомстрического анализа липидных образцов

1.7. Биофизическое и компьютерное моделирование взаимодействия

ДНК с липидами

Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы и реагенты
2.2. Объекты
2.3. Микробиологические методы
2.3.1. Среды
2.3.2. Условия культивирования
2.3.3. Световая микроскопия
2.4. Биохимические методы
2.4.1. Выделение нуклеоида Р. аигапаса
2.4.2. Выделение высокомолекулярной ДНК вмДНК Р. аигапаса
2.4.3. Определение содержания ДНК и характеризация препаратов ДНК
2.4.4. Определение эластовязкости препаратов вмДНК
2.4.5. Выделение фракций ДНКсвязанных липидов Р. аигапаса
2.4.6. Методика анализа состава бактериальных жирных кислот
2.5. Анализ жирнокислотного профиля липидных фракций методом газовой хроматографиимассспектрометрии ГХМС, анализ метиловых эфиров жирных кислот
2.5.1. Характеристика прибора, условия проведения анализа
2.5.2. Стандарты
2.6. Физикохимические методы
2.6.1. Спектроскопические методы
2.6.1.1. Получение комплексов
2.6.1.2. Спектрофотометрия
2.6.1.3. Спектроскопия кругового дихроизма
2.6.1.4. Кондуктометричсские хемосенсоры i
2.6.1.5. Атомно силовая микроскопия наноскопия
2.6.2. Изучение взаимодействия липидов и ДНК с помощью биологических
микрочипов
2.7. Статистическая обработка результатов
Результаты исследований и их обсуждение
Глава 3. Зависимость характеристик и упаковки вмДНК Р1 i, от физиологического статуса бактериальной клегки
3.1. Выделение высокомолекулярной вмДНК и геномной ДНК
3.2. Свойства высокомолекулярной ДНК i
3.3. Обсуждение
Глава 4. Зависимость жирнокислотного профиля ДНКсвязанных липидов геномной ДНК . i от состава питательной среды
4.1. Выделение фракций ДНКсвязанных липидов из препаратов вмДНК прокариот
4.2. Жирнокислотный профиль двух фракций ДНКсвязанных липидов вмДНК мясо пептонный бульон
4.3. Жирнокислотный профиль фракций ДНКсязанных липидов вмДНК Р. i, выращенной на синтетической среде
4.4. Обсуждение
Глава 5. Жирнокислотный профиль ДНКсвнзанных липидов ДНК нуклеонда. ДНКсвязанные липиды в препаратах ДНК при использовании жесткого метода выделения
5.1. Жирнокислотный профиль ДНКсвязанных липидов геномной ДИК Р. аигапНаса, выделенной детергентным методом
5.2. Жирнокислотный профиль ДНКсвязанных липидов в сравнении с профилем общих липидов Р. аигапНаса
5.3. Обсуждение
Глава 6. Зависимость взаимодействия липидов с ДНК от ее нуклеотидной последовательности. Титрование синтетических полинуклеотидов ДНК олеиновой кислотой и холестерином
6.1. УФ спектроскопия комплексов полинуклеотидов с олеиновой кислотой.
6.2. Спектры кругового дихроизма комплексов полинуклеотидов с олеиновой кислотой и холестерином
6.3. Специфичность связывания липидов олеиновая кислота и холестерин с нуклеиновыми кислотами биологические микрочипы
6.4. Кондуктометрические хемосенсоры ЗепБоЫ
6.5. Обсуждение
Глава 7. Индуцированная кардиолипином ассоциация ДНК
7.1. УФ спектроскопия комплеков полинуклеотидов с кардиолипином
7.2. Спектроскопия кругового дихроизма комплексов полинуклеотидов с кардиолипином
7.3. Изучение комплексов полинуклеотидов с кардиолипином с помощью хемосенсоров ЗепэоЫ
7.4. Атомно силовая микроскопия наноскопия
7.5. Обсуждение ИЗ
8. Заключение
Выводы
Библиографический список
Приложения
Список сокращений
АСМ сканирующая атомно силовая микроскопия наноскопия
б.б. большая бороздка ДНК
вмДНК высокомолекулярная ДНК
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭЖХМС высокоэффективная жидкостная хроматографиямасс
спектрометрия
ГХ газовая хроматография
ГХ МС газовая хроматография массспектрометрия ДГ диглицериды
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
КДспектр спектр кругового дихроизма
КЛ кардиолипин
КОН колоииеобразующие единицы
м.б. малая бороздка ДНК
МНЖК мононенасыщенные жирные кислоты
МПА мясо пептонный агар
МПБ мясо пептонный бульон
МСК масса сухих клеток
МЭЖК РАМЕ метиловые эфиры жирных кислот
НасЖК насыщенные жирные кислоты
ИГБ негистоновые белки
НенасышЖК ненасыщенные жирные кислоты
нкДНК надмолекулярный комплекс ДНК
НЛ нейтральные липиды
п.о. пара оснований ДНК
РНК рибонуклеиновая кислота
СЖК свободные жирные кислоты
СМ сфингомиелин
УФ спектр спектр поглощения в ультрафиолетовой области спетра
ФИ фосфатидилинохитол
ФС фосфатидилсерин
ФХ фосфатидилхоли н
ФЭ фосфатидилэтаноламин
Хол холестерин
ХолЭ эфиры холестерина
ЭДТА этилендиаминтстрауксусная кислота
Введение


Липидомика ставит своей целью не только изучение состава и структуры мембранных липидов и липидов, связанных с биомакромолекулами клетки, но также и ДНКсвязанных липидов. Выделяют два направления липидомики функциональная липидомика имеет цслыо понимание функций и физиологической причины разнообразия липидов и структурная липидомика, которая изучает состав, структуру и свойства липидов, связашвых с биомакромолекулами белки, полисахариды, ДНК, РНК клеточных органелл и мембран. ДНК ранее доказано, что ДКсвязанные липиды являются природным компонентом ДНК, а не артефактом процедуры выделения ДНК Стручков, Стражевская, . Показано, что ДНКсвязанные липиды имеют специфический состав, отличный от состава липидов ядерной мембраны, хроматина, ядерного матрикса, митохондрий и микросом v, v, v, . В последние годы стало ясно, что такие липиды как жирные кислоты, холестерин, диглицериды и кардиолипин являются структурно и функционально важной частью хроматина и геномной ДНК. В связи с этим можно предположить существование новых сигнальных путей, в которых принимают непосредственное участие прочносвязанные с ДНК липиды. В таких путях к активации генов в ДНК генома может приводить метаболизм фосфолипидов в результате прямого взаимодействия липидных метаболитов с молекулой ДНК, а не специализированные белки транскрипционные факторы как принято считать сейчас. Хотя в последние годы опубликовано много работ о взаимодействии с ДНК катионных липидов и о соотношении структура активность переноса генов, имеется мало сведений о комплексообразовании ДНК с низкомолекулярными липидами, в частности, жирными кислотами и холестерином. До сих пор неизвестен не только липидный состав, но и жирнокислотный профиль ДНКсвязанных липидов как прокариот, так и эукариот. Это, наряду с липидным составом, может быть крайне важно для понимания их функции в хроматине. С данной целью в нашей работе предпринят жирнокислотный анализ ДНКсвязанных липидов грамотрицательного микроорганизма i. Культура микроорганизма является наиболее простым и поэтому удобным объектом для выделения вмДНК, фракций ДНКсвязанных липидов, а также для проведения газохроматографического анализа, когда необходима воспроизводимость данных и определенное число повторов для статистики. ДНК, как заключительной стадии липидных путей передачи сигнала. Работа выполнена в НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН ряд экспериментов выполнен в Институте аналитической химии и химии окружающей среды Университета им. М. Лютера ХаллеВиттенберг, Халле, Германия. Работа выполнена при поддержке грантов ОХНМ РАН 9 , Министерства науки и образования Германии 3 i ivi i iiiiv , i и i 1. Общая характеристика работы Цели и задачи исследования. ДНК. ДНК и фракций ДНКсвязанных липидов определение жирнокислотного профиля ДНКсвязанных липидов прокариотических Р. Научная новизна работы. Доказана возможность непосредственного взаимодействия липидов с ДНК, как заключительного этапа липидного пути передачи сигнала. Определен жирнокислотный профиль ДНКсвязанных липидов прокариот Р. Наса. В результате анализа этих данных выявлены базовые жирные кислоты и их соотношения, характерные для изученных объектов. На препаратах ДНК нуклеоида прокариот продемонстрирован факт существования фракции липидов, прочно связанных с ДНК. Впервые исследована специфичность взаимодействия нейтральных липидов олеиновая кислота и холестерин и фосфолипидов кардиолипин с синтетическими полинуклеотидами ДНК. Выявлены нуклеотидные последовательности в АТбогатых олигонуклеотидах, специфически взаимодействующие с олеиновой кислотой и холестерином. Обнаружено явление кадиолипининдуцированной конденсации ДНК. Взаимодействие липидов с ДНК специфично нейтральные липиды олеиновая кислота и холестерин избирательно связываются с АТТАбогатыми участками. Кардиолипин переводит ДНК в конденсированное состояние, что имеет важное значение для процессов репликации и репарации. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на , v i, , , Ii i i, i 3, , , II Всероссийский Биохимический Съезд, С. Петербург, Россия, 6 i i i i, i, , i i, vi , i i I. Ii, , , , , .