ДНК-гидролизующие аутоантитела и их влияние на рост клеток in vitro

• Автор: Темников, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 134 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АУТО АНТИТЕЛ А К ДНК

И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ.

1.1. Аутоантитела.

1.1.1. Аутоиммунитст

1.1.2. Разнообразие аутоантител.

1.1.3. Аутоаититела при различных аутоиммунных заболеваниях АИЗ

1.2. Аутоантитела к ДНК.

1.2.1. Общая характеристика аутоантител к ДНК.

1.2.2. Происхождение аутоантител к ДНК
1.2.3. Структура аутоантител к ДНК
1.3. Системная красная волчанка СКВ.
1.3.1. СКВ общая характеристика
1.3.2. Люпуснефрит.
1.3.3. Разнообразие аутоантител при СКВ.
1.3.4. Определение уровня аутоантител к ДНК.
1.4. Патогенные аутоантитела к ДНК
1.5. Механизмы действия аутоантител к ДНК на клетки
1.6. Каталитические антитела
1.6.1. Открытие новых функций антител.
1.6.2. Механизмы каталитического действия антител.
1.6.3. Природные каталитические антитела
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Оборудование и реактивы
2.2. Буферные растворы и питательные среды
2.3. Объекты исследования.
2.3.1. Кровь
2.3.2. Клеточная линия СПЭВ.
2.4. Получение высокоочищекных препаратов 1С
из сыворотки крови.
2.4.1. Выделение белковой фракции.
2.4.2. Фракционирование белков сыворотки крови
методом ионообменной хроматографии
2.4.3. Очистка белковых фракций
методом аффинной хроматографии
2.5. Анализ состава белковых фракций.
2.5.1. Электрофоретический анализ белковых фракций
в полиакриламидном геле
2.5.2. Иммуноферментный анализ
2.6. Изучение ДНКгидролизующих свойств АТ к ДНК.
2.6.1. Гидролиз плазмидной ДНК рВР2 антителами к ДНК
2.6.2. Электрофоретический анализ плазмидной ДНК
в агарозном геле.
2.7. Изучение влиянии антител к ДНК на рост клеточной культуры
2.7.1. Культивирование клеточного монослоя е АТ к ДНК.
2.7.2. Культивирование клеток с АТ к ДНК с момента пересева
2.8. Статистическая обработка результатов измерений
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
3.1. Получение высокоочищенных фракций I,
содержащих антитела к ДНК
3.1.1. Гельфильтрация и ионообменная хроматография.
3.1.2. Аффинная хроматография.
3.2. Изучение дсзоксирибонуклеазной активности ААТ к ДНК.
3.2.1. Количественная оценка результатов электрофореза
3.2.2. Храктеристика плазмидной ДНК.
3.2.3. Влияние прединкубации антител на их ДНКазную активность
3.2.4. Зависимость ДНКазной активности АТ к ДНК от реакционной смеси, концентрации ионов двухвалентных металлов и АТФ
3.2.5. Гидролиз плазмидной ДНК аутоантителами.
3.3. Влияние ААТ к ДНК на рост клеток линии СПЭВ.
3.3.1. Зависимость прироста клеток от концентрации I
3.3.2. Рост клеток линии СПЭВ при внесении АТ к ДНК
в суспензию клеток и в монослой
3.3.3. Влияние гормональной терапии на i стимулирующую способность фракций АТ к ДНК
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЛИТЕРАТУРА


Таким образом, уже в начале XX века аутоиммунизация, с одной стороны, рассматривалась как нежелательная и вредная для организма, а с другой стороны, достаточно часто обнаруживалась на фоне клинического благополучия. Вся последующая история развития учения об аутоиммунном ответе это история выработки концепции, объединяющей эти несовместимые, на первый взгляд, факты . В г. Г1. Грабарь выдвинул идею о том, что аутоиммунитет представляет собой нормальный механизм для транспорта и утилизации ААГ, не деградированных системой ауто лиги чески х ферментов. В организме для утилизации компонентов собственных разрушающихся или мутировавших клеток в небольших количествах всегда циркулируют ААТ, являющиеся компонентом нормального Вклеточного репертуара, а также формируются комплексы антигенантитело иммунные комплексы 4, . Такой иммунитет Грабарь назвал физиологическим. АГ и рассматривается не как патология, а как необходимое условие нормального функционирования иммунной системы. Однако в ряде случаев аутоиммунитет может приобретать патологический характер, приводя к развитию тяжелых воспалительных реакций в разных органах и тканях . В настоящее время нет теории, однозначно объясняющей этот феномен. Предполагается, что аутоиммунизация развивается двумя основными путями 1 как следствие появления запретных клонов иммунокомпегентных клеток, способных вырабатывать антитела к неизмененным антигенам собственного организма, или 2 в результате денатурации собственных белков антигенов, которые для иммунокомпетентных клеток становятся чужеродными, однако образующиеся к этим антигенам антитела взаимодействуют и с неизмененными антигенами. ААТ входят в нормальный пул АТ, хотя в крови здоровых людей и животных их количество намного меньше, чем при патологии. В здоровом организме нормальным ААТ отводится роль транспортеров уже отживших макромолекул, вышедших из естественно разрушающихся клеточных и субклеточных структур. Главным аргументом в пользу этого представления служит то, что у большинства здоровых индивидуумов в крови обнаруживаются малые концентрации аутоантител против нормальных антигенных субстанций . Иммунологическая специфичность белков организма может изменяться под влиянием физических, химических, бактериальных и других факторов. Для ААТ, в отличие от обычных АТ, характерна полиспецифичность, т. АГ, и более низкая аффинность 8. В начале х на основе многочисленных данных появились гипотезы о наличии АТ к эндогенным регуляторам катехоламинам, пептидам, биогенным аминам и их функциях Табл. . Как видно из таблицы, практически по всем показателям, за исключением I к брадикинину и I к гистамину, имеется достоверное различие между больными системной красной волчанкой и здоровыми донорами. Вопреки ожиданиям, оказывается, что при общей гиперфункции морального иммунитета, свойственной СКВ, у больных отмечается значительное снижение уровней АТ к исследованным АГ. В настоящее время доказано 4 присутствие ААТ к соматостатииу нейрогормон, тормозящий синтез и секрецию гормона роста и продинорфину предшественник нейромедиаторов динорфинов , которые определяются обычно при психических и неврологических заболеваниях шизофрения болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и др. Интересно отметить, что при возникновении и развитии рассеянного склероза обнаруживают присутствие также и аутоиммунной компоненты . Заметим, что разные формы психических и неврологических заболеваний сопровождаются не только повышением, но при некоторых патологиях и понижением уровня этих антител 6. Обнаружены ААТ к определнным типам простагландииов, а также к ключевым ферментам метаболических путей организма топоизомеразе, глутаматдекарбоксилазе, ацетилхолинэстеразе, миелопсроксидазе, полимеразе полиаденозиндифосфатрибозы и др. Другой пример исследования антител к тканевому калликрсину одному из медиаторов воспаления, активирующему хемотаксис полиморфноядерных лейкоцитов фагоцитов . Установив высокий уровень антител к калликреину при воспалительных процессах, с соавторами 6 исследовали природу этих антител и отнесли их к иммуноглобулинам .