Действие препарата лизоамидаза и его компонентов на эндоспоры бактерий рода Bacillus

• Автор: Чайка, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 163 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Бактериолитические ферменты

1.1. Распространенность бактериолитических ферментов

в природе

1.2. Внутриклеточные автолитические бактериолитические ферменты

1.2.1. Свойства автолитических ферментов

1.3. Внеклеточные бактериолитические ферменты

1.4. Внеклеточные бактериолитические комплексы

1.5. Субстратная специфичность бактериолитических ферментов

ГЛАВА 2. Структура клеточной стенки бактерий

субстрата бактериолитических ферментов
2.1. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий
2.2. Клеточная стенка грамположительных бактерий
2.3. Строение пептидогликана бактерий
ГЛАВА 3. Покоящиеся формы бактерий
3.1. Спорообразующие бактерии
3.1.1. Классификация спорообразующих
бактерий
3.1.1.1. Анаэробные спорообразующие бактерии
3.1.1.2. Аэробные спорообразующие бактерии
3.1.2. Жизненный цикл спорообразующих бактерий
3.1.2.1. Характеристика бактериальных эндоспор
ГЛАВА 4. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. Материалы и методы
5.1. Материалы
5.2. Микроорганизмы и условия их культивирования
5.3. Получение препаратов зрелых спор
5.4. Определение ферментативных активностей
5.4.1. Определение бактериологической активности
5.4.2. Определение дрожжелитической активности
5.4.3. Определение протеазной активности
5.4.4. Определение пептидазной активности
5.5. Определение количества белка
5.6. Получение лизоамидазы
5.7. Выделение и очистка компонентов лизоамидазы
5.7.1. Выделение пептидаз Л и Л4
5.7.1.1. Осаждение белков сульфатом аммония
5.7.1.2. Ионообменная хроматография
на СМсефадексе С
5.7.1.3. Ионообменная хроматография
на сефадексе С
5.7.1.4. Гельфильтрация на сефакриле 0
5.7.1.5. Электрофоретический анализ ферментных препаратов
5.7.2. Выделение и очистка ацетилмура юилЬаланин амидазы I2 и мурамидазы М
5.7.3. Выделение и очистка металлопротеазы лизоамидазы
5.7.4. Выделение и очистка полисахарида лизоамидазы
5.8. Реконструкция ферментполисахаридного комплекса
5.9. Характеристика полученных ферментных препаратов
5.9.1. Вестернблоттинг
5.9.2. Идентификация концевых аминокислотных последовательностей молекул ферментов
5.9.3. Определение оптимального значения для действия нового бактериолитического фермента
и металлопротеазы
5.9.4. Определение оптимального значения концентрации буфера для действия ферментов I
и металлопротеазы
5.9.5. Определение влияния температуры на проявление активности ферментов Л4 и металлопротеазы
5.9.6. Определение термостабильности ферментов Л
и металлопротеазы
5.9.7. Определение действия ингибиторов на активность ферментов Л4 и металлопротеазы
5.9.8. Определение заряда фермента Л
методом электрофореза
5.9.9. Определение молекулярных масс
ферментов Л и Л4
5 Изучение действия лизоамидазы и ее компонентов
на эндоспоры бактерий рода i
. Изучение действия лизоамидазы и лизоцима
на зрелые споры бацилл с выявлением результатов на жидкой среде
. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бацилл с выявлением результатов
на твердой среде
. Изучение действия лизоамидазы на зрелые споры бацилл с выявлением результатов нр, жидкой среде
с последующим высевом на твердую среду
. Изучение действия гомогенных
ферментов лизоамидазы, полисахарида лизоамидазы и реконструированных ферментполисахаридных комплексов на зрелые споры бацилл
. Обработка спор, ii , В. ii 8 и В. 2 лизоамидазой для последующего исследования методом
атомносиловой микроскопии
ГЛАВА 6. Результаты исследования и их обсуждение
6.1. Изучение действия лизоамидазы
на зрелые споры бактерий рода i
6.2. Исследование спор В. ii , В. ii
и В. 7, обработанных лизоамидазсй, методом атомносиловой микроскопии
6.3. Изучение роли компонентов лизоамидазы в действии препарата на зрелые споры бактерий рода i
6.3.1. Выделение, очистка и характеристика
компонентов лизоамидазы
6.3.1.1. Выделение пептидазы Ii и обнаружение ранее неизвестного бактериолитического фермента Л4
6.3.1.2. Изучение основных физикохимических свойств нового бактериолитического фермента Л4
6.3.1.3. Выделение и очистка ацетилмурамоилЬаланин амидазы Л2 и мурамидазы М
6.3.1.4. Выделение и очистка металлопротеазы лизоамидазы
6.3.1.5. Выделение и очистка экзополисахарида лизоамидазы и реконструирование ферментполисахаридного комплекса
6.3.2. Изучение действия отдельных ферментов лизоамидазы,
полисахарида лизоамидазы и вариантов реконструкции препарата на зрелые споры бактерий рода i
6.4. Обнаружение дрожжелитической активности
металлопротеазы препарата лизоамидаза
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В ходе работы выделен новый бактериолитический фермент бактерии . X 1 I4. Разработана схема очистки фермента Л4, при использовании которой он может быть получен в электрофоретически гомогенном состоянии. Установлена концевая аминокислотная последовательность молекулы фермента Л4. При сравнении данной последовательности с белковыми последовательностями, представленными в базах данных I, i и i i, выявлено, что бактериолитический фермент . X 1 Л4 гомологов не имеет, а, следовательно, является новым, неизвестным ранее белком. Определены основные физикохимические свойства фермента Л4. Показано, что пептидогликан . X 1 бактериолитический фермент Л4 гидролизует как диаминопимелиноилапанин эндопептидаза. Обнаружено, что металлопротеаза лизоамидазы не участвует в спороцидном действии препарата, но способна эффективно лизировать клетки дрожжей vii. Изучены основные физикохимические свойства металлопротеазы на новом субстрате на клетках дрожжей . Определена концевая аминокислотная последовательность молекулы металлопротеазы. Установлено, что металлопротеаза бактерии . X 1 по концевой аминокислотной последовательности гомологична ахромолизину i на . Научнопрактическое значение. Так, лизоамидаза, гомогенная эндопептидаза I и экзополисахарид лизоамидазы были переданы сотрудникам ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии М3 РФ г. Оболенск для изучения их действия на вегетативные клетки и споры i i и лечения данными препаратами зараженных сибиреязвенным микробом животных. Лизоамидаза оказывает бактерицидное действие на вегетативные клетки, прорастающие споры и покоящиеся споры В. Гомогенный бактериолитический фермент эндопептидаза Л оказывает бактерицидное действие только на вегетативные клетки В. Лизоамидаза оказывает лечебный эффект по отношению к экспериментальной сибиреязвенной инфекции, вызванной у белых мышей и золотистых хомяков введением спор В. СТИ, устойчивого к рифампицину, ампициллину, тетрациклину и доксициклину. Бактериолитическая эндопептидаза Л оказывает лечебный эффект по отношению к модели сибиреязвенной инфекции, вызванной у белых мышей введением вегетативных клеток вакцинного штамма, i . Такой же эффект оказывает эндопептидаза Л1 в сочетании с полисахаридом лизоамидазы. По полученным результатам подготовлена заявка регистрационный на патент Средство, обладающее бактерицидным действием в отношении вегетативных и споровых клеток i i, способ профилактики и лечения сибирской язвы, авторы Кулаев И. С., Степная О. А., Бегунова Е. А., Цфасман И. М., Логвина Чайка И. А., Маринин Л. И., Старицын Н. А., Шишкова Н. ГЛАВА 1. Бактериолитическис ферменты. Распространенность бактериолитических ферментов в природе. Бактериолитические ферменты это ферменты, способные разрушать клеточные стенки бактерий, и тем самым вызывать лизис бактериальной клетки. Еще в начале XX века ученые обратили внимание на способность выделений и экстрактов тканей животных визировать суспензии некоторых грамположительных бактерий. Так, в г. П. Н. Лащенков впервые описал бактериолитические свойства белка куриного яйца и предположил, что это может быть связано с присутствием в нем специфического энзима Егоров, . Спустя лет английский микробиолог А. Флеминг открыл и выделил из некоторых биологических жидкостей и тканей человека бактериолитический фермент лизоцим i, . С тех пор и до настоящего времени Еедется интенсивная работа по изучению бактериолитических ферментов. Наиболее изученными бактериолитическими ферментами растительного, грибного и животного происхождения являются лизоцимы. Они содержатся в молоке, слизи, моче и тканях животных, а также в некоторых тканях растений и грибов , . Нага, i, I ii, , , , , при этом наибольшая концентрация лизоцима 2,6 обнаружена в яичном белке Головина, . Кроме лизоцимов, в сыворотках человека и некоторых млекопитающих также были обнаружены бактериолитические ацетилмурамоилЬштнин амидазы Vi . Принято считать, что бактериолитические ферменты растений, животных и других высших организмов являются частью их иммунной системы и выполняют защитные функции I . Vi , .