Влияние температурного стресса на пероксидазу в культуре ткани Rawuolfia serpentina Benth

• Автор: Мулла Ахмад Исмаил
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 111 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структура пероксидазы.

1.2 Физикохимические свойства растительных пероксидаз.

1.3 Распространение и субклеточная локализация пероксидазы.

1.4 Биологическая и физиологическая роль пероксидазы.

1.4.1 Возможные механизмы участия пероксидазы в формировании ответных реакций на действие различных стрессфакторов.

1.5 Биосинтез пероксидазы

1.6 Молекулярная гетерогенность пероксидазы.

1.7 Механизм действия пероксидазы .г Г

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты исследования и метод культивирования ткани
2.2 Выделение цитоплазматической фракции пероксидазы из культуры ткани РаиУоШа зегрепйпа
2.3 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани КатлюШа зегрепПпа.
2.4 Определение концентрации белка
2.5 Определение активности пероксидазы
2.6 Электрофоретические методы
2.6.1 Электрофорез в пластинах полиакриламидного геля
2.6.2 Определение активности пероксидазы в геле
2.7 Иммунологические методы
2.7.1 Получение антисыворотки к пероксидазе
2.7.2 Радиальная иммунодиффузия в агаровом геле
2.7.3 Определение концентрации антигена
2.8 Радиоиммунонлогические методы
2.8.1 Определение параметров кругооборота пероксидазы и общего белка
2.9 Статистическая обработка результатов эксперимента.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Активность пероксидазы и концентрация белка в динамике роста ЛатуоШа зегрепбпа, штамм К
3.1.1 Подбор оптимальных условий определения активности
3.2 Изучение кинетики пероксидазы на разных этапах роста каллусной культуры ЛатуоШа зегрепбпа.
3.3 Молекулярная гетерогенность пероксидазы в процессе культивирования штамма ЛатуоШа зегрепбпа.
3.4 Выделение и очистка пероксидазы из культуры ткани ЛатуоШа Бегрепбпа.
3.4.1 Подбор оптимальных условий высаливания
3.5 Определение молекулярной массы пероксидазы, влияние температуры и на ее активность.
3.5.1 Влияние температуры и на активность пероксидазы.
3.6. Изучение параметров обмена пероксидазы и общего белка в
культуре ткани ЛаиУо1йа зегрепбпа
3.7 Исследование специфичности антипероксидазиой сыворотки
3.8 Влияние высоко и низкотемпературного шока на активность и кинетические параметры пероксидазы в культуре ткани ЛатУоШа зегрепйпа.
3.8.1. Влияние температурного шока на кинегические параметры
пероксидазы
3.9 Молекулярная гетерогенность пероксидазы при высоко и низкотемпературном шоке.
3. Обмен внутриклеточного белка и пероксидазы в культуре ткани Лаиуо1йа БсгрепПпа
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Е концентрация фермента
Ка константа скорости деградации
к5 константа скорости синтеза
кт константа скорости Михаэлиса
ЛБТС 2,2иазииобнс3этилбепзтиазолип6сульфопатаммопия
ИУК индолилуксусная кислота
НЛДН пикотииамидадепиидипуклеотид, восстановленная форма
НАДФН иикотииамидадепиндипуклеотидфосфат, восстановленная форма
н2о2 перекись водорода
ПАЛГ полиакриламидный гель
ПФД пфепилдиамин
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
ТЭМЭД Н,КтКрте1раметилэтилепдиамип
ТХУ тр и х л ору ксу с пая к и сл о га
Трис трисоксиметиламимометап
ДСНа додецилсульфат натрия
Т.2 время полужизпи
ЭЕАЕ диэтиламиноэтил
ВВЕДЕНИЕ


Это связано, с одной стороны, с перспективностью их использования в качестве продуцентов ценных биологически активных веществ, а с другой в качестве модели для изучения молекулярных механизмов протекания тех или иных процессов в растительных клетках. Изолированные клетки растений находят все большее применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов. Кроме того, исследование механизмов клеточного метаболизма в дедифференцированых т. Растения рода ЯашУоШа известны как перспективный источник получения многих алкалоидов, применяемых в медицинской практике. В СанктПетербургской химикофармацевтической академии в результате многолетней селекции культуры ткани Яаиуойа яегрепбпа получен высокоэффективный штамм суперпродуцент аптиаритмических алкалоидов. В процессе селекции использованы различные мутагены и иные стрессовые факторы, что привело к существенному изменению биохимических процессов, протекающих в культивируемых клетках Яаидуоба БегреШта. В рамках осуществления биохимического контроля за состоянием клеточных культур анализировали пероксидазу один из основных ферментов метаболизма кислорода. Этот фермент принимает участие в каталитическом окислении различных субстратов, таких как фенолы, ароматические амины и др. Факт, что пероксидаза присутствует в микробных, растительных и животных клетках дает основание считать его жизненно важным соединением. Имеется много работ, посвященных биологической активности этого фермента, однако анализ синтеза и стабильности пероксидазы ранее ни кем не изучался. Мы полагаем, что такого рода исследования могут быть весьма актуальными, т. Изучить динамику изменения активности, физикохимические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусной культуры i. Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани i, изучить ее физикохимические свойства и получить к ней мопоспецифические антитела. Оцепить скорость синтеза, распада и время функционирования в клетках ткани i. Исследовать влияние температурного шока на содержание и свойства пероксидазы, ее молекулярную гетерогенность в культивируемых растительных клетках. Научная новизна. В работе впервые была изучена динамика изменения перокендазной активности растущей культуры клеток i. Также впервые были изучены такие параметры, как молекулярная гетерогенность, синтез и стабильность пероксидазы. Разработан способ ее выделения и очистки до гомогенного состояния, изучены физикохимические свойства пероксидазиого белка. В работе изучено влияние низко и высокотемпературного стресса на состояние пероксидазы и общего белка в каллусной культуре ткани i. Показано более выраженное повреждающее действие низкотемпературного шока. Теоретическая и практическая значимость Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физикохимических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидазы в каллусиой культуре ткани ЯаиУоШа БегрепПпа позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культуре растительных клеток. Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительных клеток, а также о протекторном действии пероксидазы, защищающей клетку от повреждения различными токсическими продуктами, возникающими в результате температурного воздействия. Учитывая тот факт, что работа проводилась с промышленным штаммом ЯаижоШа БегрепНпа, знание белкового обмена этого штамма может оказать весьма существенную помощь при дальнейших селекционных работах. Кроме того культура ткани ЯашУоШа БегрепЦпа может быть использована в качестве источника для получения пероксидазы. Структура и объем диссертации. Работа изложена па 1 страницах машинописи, содержит таблиц и рисунка . Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, который включает в себя наименований.