Взаимодействие апотранскетолазы пекарских дрожжей с тиаминпирофосфатом

• Автор: Кочевова, Наталья Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Реконструкция холотранскетолазы из апо и кофермента.

1. Двустадийность процесса взаимодействия кофермента с апотранскетолазой.

2. Функциональные группы апо и кофермента, участвующие в реконструкции холотранскетолазы.

2.1. Функциональные группы апотранскетолазы.

2.1.1.Остатки гистидина

2.1.2.0статки триптофана.

2.1.3. Карбоксильные группы

2.2. Функциональные группы тиаминпирофосфата

2.2.1. 4ЧЧНггруппа пиримидинового кольца.

2.2.2. Пирофосфатная группа

2.2.3. Метильные группы
3. Комплекс с переносом заряда в молекуле транскетолазы
4. Количество активных центров, их каталитическая эффективность.
5. Участие двухвалентных катионов в связывании тиаминпирофосфата апотранскетолазой
6. Неэквивалентность активных центров транскетолазы по связыванию кофермента
7. Структура коферментсвязывающего участка
транскетолазы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. МАТЕРИАЛЫ
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Выделение транскетолазы из пекарских дрожжей.
2.1.1. Приготовление иммуносорбента.
2.1.2. Выделение и очистка транскетолазы
2.1.3. Определение активности транскетолазы.
2.1.4. Определение белка
2.2. Получение субстратов транскетолазы.
2.2.1. Выделение рибозофосфатизомеразы и рибулозофосфатЗэпимеразы из селезенки быка.
2.2.2. Получение рибозо5фосфата.
2.2.3. Получение бариевой соли смеси фосфопентоз
2.3. Определение чистоты препарата тиаминпирофосфата
2.4. Определение концентрации тиаминпирофосфата.
2.5. Постановка экспериментов и обработка получаемых результатов.
2.5.1. Постановка экспериментов.
2.5.2. Обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Взаимодействие нативной транскетолазы пекарских дрожжей с тиаминпирофосфатом
3.1.1. Связывание кофермента с транскстолазой в присутствии кальция.
3.1.2. Связывание кофермента с транскетолазой в присутствии магния
3.2. Взаимодействие мутантной по i 3 транскетолазы
с тиаминпирофосфатом
3.2.1. Связывание кофермента с мутантной апотранскетолазой
в присутствии кальция.
3.2.2. Связывание кофермента с мутантной апотранскетолазой
в присутствии магния
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
4.1. Механизм реконструкции холотранскетолазы.
4.2. Взаимодействие нативной транскетолазы пекарских дрожжей
с тиаминпирофосфатом.
4.3. Взаимодействие тиаминпирофосфата с мутантной по i 3 транскетолазой
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕР АТУРЫ
Список сокращений.
ГАФД глицеральдегидфосфатдегидрогеназа ДОА диоксиацетон
ДОЭТПФ диоксиэтилтиаминпирофосфат
К5Ф ксилулозо5фосфат
КД круговой дихроизм
КПЗ комплекс с переносом заряда
ГП гидроксипируват
ПДК пируватдекарбоксилаза
Р5Ф рибозо5фосфат
С7Ф седогептулозо7фосфат
ТМФ тиаминмонофосфат
ТПФ тиаминпирофосфат
ТК транскетолаза
Ф6Ф фруктозо6фосфат
Введение


Функциональные группы апотранскетолазы. ЧЧНггруппа пиримидинового кольца. Количество активных центров, их каталитическая эффективность. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Выделение транскетолазы из пекарских дрожжей. Приготовление иммуносорбента. Определение активности транскетолазы. Получение субстратов транскетолазы. Выделение рибозофосфатизомеразы и рибулозофосфатЗэпимеразы из селезенки быка. Получение рибозо5фосфата. Определение концентрации тиаминпирофосфата. Постановка экспериментов и обработка получаемых результатов. Постановка экспериментов. Связывание кофермента с транскстолазой в присутствии кальция. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Механизм реконструкции холотранскетолазы. Список сокращений. Введение. Транскетолаза седогептулозо7фосфат ОглицеральдегидЗфосфат гликольальдегидтрансфераза, КФ 2. Катализирует расщепление кетозы субстратдонор по СС связи, соседней с кетогруппой, и последующий перенос двууглеродного фрагмента остатка гликолевого альдегида на альдозу субсгратакцептор. Субстратамидонорами являются кетозы, у которых имеется гидроксильная группа при первом атоме углерода, а гидроксильные группы при 3м и 4м асимметрических атомах углерода находятся в трансположении. Исключение составляют трхуглеродные кетозы ГП и ДОА, не имеющие асимметрического атома углерода рис. Фермент мало специфичен по отношению к длине углеродной цепочки наличие фосфатной группы в молекуле субстратадонора существенно повышает его сродство к ферменту 1 . Субстратамидонорами в транскетолазной реакции являются ксилулозо5фосфат, фруктозо6фосфат, эритрулозо4фосфат, Ексилулоза, Ифруктоза, Ьэритрулоза и др. В качестве субстратаакцептора могут функционировать Эглицеральдегид3фосфат, Прибозо5фосфат, Оэритрозо4фосфат, гликольальдегид и др. Транскетолазная реакция обратима, за исключением того случая, когда роль субстрагадонора выполняет ГП. НСОН НСОН
ГрУОСНОН нс он
Гроснон
Рис. Тиаминпирофосфат. Некоторые субстратыдоноры транскетолазной реакции. Звездочкой обозначены асимметрические атомы углерода. ТК была открыта в г. Локализуется преимущественно в растворимой фракции клетки. Кофакторами ТК являются ионы двухвалентных металлов Са2, 2 и др. ТПФ рис. На сегодняшний день наиболее полно исследованы свойства ТК пекарских дрожжей. Фермент имеет молекулярную массу, равную кДа, и состоит из двух идентичных субъединиц, не связанных между собой ковалентными связями . Два его активных центра 6,7 расположены на границе между контактирующими поверхностями субъединиц 2. Активные центры характеризуются одинаковой ферментативной активностью 7 . К настоящему времени получена достаточно подробная информация о кристаллической структуре фермента 2,8 , его оптических свойствах и их изменениях при связывании различных лигандов 1, , , о константах диссоциации кофермента , Кш для субстратов 1, и Vx с различными субстратами 1, . Определен аминокислотный состав и первичная структура фермента , охарактеризована также его вторичная структура . Полагают, что в состав активного центра ТК входит остаток триптофана, участвующий в связывании ТПФ с белком, возможно, путм взаимодействия с тиазолиевым кольцом кофермента , , . Методом фотоинактивации, а позже и рентгеноструктурным анализом, показано наличие остатка или нескольких остатков гистидина в активном центре ТК 2, , . Предполагается, что этот остаток тоже принимает участие в связывании кофермента апотранскетолазой. Получены данные, свидетельствующие о наличии карбоксильных групп в активном центре ТК, вероятно, необходимых для связывания кофакторов ТПФ и двухвалентного катиона 2, , . Считается, что они нужны для связывания субстратовдоноров. Несмотря на то, что достаточно хорошо изучена структура ТК и общий механизм тиаминового катализа, по существу нет данных о кинетическом механизме функционирования ТК. Целью настоящей работы было изучение кинетического механизма процесса взаимодействия кофермента с апоТК пекарских дрожжей в присутсвии различных двухвалентных катионов, определение кинетических характеристик индивидуальных стадий этого процесса.