Белковые трансактиваторы гена интерлейкина-2 из ядер клеток селезенки и головного мозга

• Автор: Гришина, Татьяна Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 169 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Научнопрактическое значение

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Регуляция врожденного иммунитета центральной

нервной системы

2.1.1. Регуляция иммунитета, опосредованная НРА осью

Гормональная петля обратной связи между иммунной системой и ЦПС

Эффекты глюкортикоидов на функции и перемещение иммунных клеток
2.2. Региональный контроль иммунитета симпаптической
нервной системой
2.2.1. Эффекты СНС на адаптивный иммунитет
2.2.2. Эффекты норадреналина и нейропептида на врожденный иммунитет
2.3. Цитокины и центральная нервная система
2.3.1. Цитокины как медиаторы нейроиммунных взаимодействий
2.3.2. Пути активации провоспапительных цитокинов в микроглии
2.3.3. Эффекты интерлейкина2 на ЦНС
2.4. Генеральные механизмы активации Тлимфоцитов
2.4.1. сигнализация
Тклеточиый рецептор
Активация тирозин киназ
Сборка сигналосомы Тклеточного рецептора
Липидныерафты в Тклеточной сигнализации
Генерация Са2сигнала, активация транскрипционного фактора
МАРкиназпые пути, активация транскрипционных факторов кВ и АР
индуцированное изменение актинового цитоскелета
2.4.2. С8костимуляция
2.4.3. Иммунологический синапс
Формирование . Перераспределение молекул адгезии и в процессе формирования
Роль сигнализации в формировании
2.5. Регуляция экспрессии гена интерлейкина2
2.5.1. Интерлейкин2 I2 и его рецептор
2.5.2. Ген интерлейкина2. Регуляторные сайты
и транскрипционные факторы
транскрипционные факторы
АР1 транскрипционные факторы
кВ транскрипционные факторы
Октамерсвязывающие протеины 1 и 2.

i2
2.5.3. Коактиваторы транскрипции цитокиновых генов
Архитектурные протеины
Транскрипционные коактиваторы СВР и рЗОО
2.5.4. Структура хроматина минимального промотора I
гена в покоящихся и активированных Тклетках
Позиционированная нуклеосома на промоторе I2 гена
Гипотетический комплекс энхансеосомы, собираемый на I2 промоторе
3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Трансформация клеток Е.со плазмидной ДНК с применением хлористого кальция
3.2. Выделение плазмидной ДНК из Е.со методом
щелочной экстракции
3.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
3.4. Электрофорез рестрикционных фрагментов ДНК
в агарозном геле
3.5. Выделение рестрикционных фрагментов ДНК
из лекгоплавкой агарозы
3.6. Мечение ДНКфрагмснтов дигоксигениновым методом
3.7. Выделение и фракционирование ядер
3.8. Выделение белковых экстрактов из ядер
3.9. Дискэлектрофорез ЯБС и ЯБМ в полиакриламидном
геле в присутствии ДЦС1Ча
3 Дискэлектрофорез ЯБМ, ЯБС и препарата тотальных гистонов в ПААГ в кислых буферных растворах с присутствием 2,5 М мочевины
3 Электроблоттинг и формирование комплексов ДНКбелок
3 Вестернблоттинг ЯБС и ЯБМ с поликлональными антителами к компонентам трансфактора АР1
3 Получение и инкубация лимфоцитов
3 Реакция бласттрансформации Тлимфоцитов
3 Определение люциферазной активности
3 Выделение мРНК Б2 и оценка ее количества методом согибридизации
3 Выявление комплекса ОДНКмРНК и iДНКбелок
3 Модель стресса
3 Статистический анализ результатов исследования
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Выделение и физикохимическая характеристика ядерных
белков из ткани головного мозга и селезенки крыс
4.2. Взаимодействие ЯБС и ЯБМ с ДНК промотора гена .
Локализация участков связывания
4.3. Оценка взаимодействия ЯБМ и ЯБС с поликлональными антителами к компонентам трансфактора АР1
4.4. Комитогенное действие ЯБС и ЯБМ в реакции бласттрансформации Тлимфоцитов
4.5. Трансактивирующее действие ЯБМ и ЯБС на промотор гена в модельной системе ЛгксК клеток,
трансфецированных плазмидной ДНК р1Ь2ШС
4.6. Стимуляция ЯБС и ЯБМ синтеза мРНК 1Ь2 в культуре Тлимфоцитов
4.7. Действие ЯБС и ЯБМ в присутствии иммунодепрессанта циклоспорина А
4.8. Влияние ЯБС и ЯБМ на синтез мРНК 1Ь2 Тлимфоцитами животных, подвергнутых иммобилизационному стрессу
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Центральная нервная и иммунные системы ЦНС и ИС являются главными адаптивными системами организма. Во время иммунного ответа ЦНС и ИС поддерживают обширные коммуникации друг с другом и этот процесс важен для поддержания гомеостаза организма. ЦНСопосредованная регуляция иммунитета осуществляется через системные, региональные и локальные пути. Как известно, клеточные и молекулярные компоненты врожденной иммунной системы обеспечивают первую линию защиты против вторгшихся патогенов е. Периферическая нервная система обеспечивает эту первую линию обороны по локальным сайтам воспаления посредством высвобождения сенсорными нервными окончаниями нейропептидов кортикотропинрелизинг гормон, субстанция Р и , которые обычно увеличивают локальные воспалительные ответы, стимулируя продукцию провоспалительных цитокинов. Иммунные медиаторы и цитокины впоследствии высвобождаются врожденной иммунной системой и включают региональные нервные и системные нейроэндокринные ответы. Симпатическая или адренэргическая нервная система СНС и парасимпатическая или холинэргическая нервная система ПНС обычно регулирует воспаление на региональном уровне посредством иннервации иммунных органов и клеток. Активируя различные адренэргические и пуринэргические рецепторы
иммунных клеток, эти трансмиттеры стимулируют продукцию анти или провоспалительных цитокинов и 0. Поскольку регуляция освобождения нейротрансмиттеров из нервных окончаний осуществляется по принципу обратной связи, изменение содержания любого из них в экстраклеточном пространстве вносит вклад в конечный иммунологический эффект , i, . Этот эффект в основном сводится к подавлению врожденных иммунных ответов. Аналогичное воздействие на врожденный иммунитетеоказывает ППС посредством освобождения ацетилхолина из эфферентных фибрилл . Являясь главным нейротрансмиттером ПНС, ацетилхолин связывается с никтиноподобными и мускариновыми рецепторами и подавляет продукцию провоспалительных цитокинов иммунными клетками и органами. Наконец, нейроэндокринные ответы контролируют воспаление на системном уровне посредством гииоталамусгипофизнадпочечники НРА оси через антивоспалительные эффекты глюкокортикоидов, освобождаемых из коры надпочечников. Активность НРАоси напрямую зависит от уровня провоспалительных цитокинов в головном мозгу. Благодаря этому формируется нейроэндокринная петля обратной связи между ЦНС и иммунной системой v е. ЦНС. Эти воздействия могут осуществлять перекрестную сенсибилизацию, что усиливает нейроэндокринные эффекты в ответ на более поздние стрессорные вызовы. Важную роль в ряде этих процессов играют микроглия, астроциты и взаимодействия гипоталамуса и передней доли гипофиза, определяющие I и 2 ответы ii, i, i, i i, Мюльберг, Гришина, . ЦНС до конца не изучены. АР1 и , и кВ е. ЦНС i, . Однако остается не ясным, обусловлены ли эти эффекты участием перечисленных трансфакторов в активации гена 2. Более того, эндогенный синтез I2 в ЦНС остается предметом дискуссии i, . Не исключено, что разрушение гематоэнцефалического барьера периферическими провоспалительными цитокинами I и может позволить циркулирующим в крови цитокинам, в том числе и I2, проникнуть через паренхиму мозга и получить доступ к их рецепторам, экспрессируемым на популяциях нейрональных и глиальных клеток ii е. В связи с вышеизложенным представлялось актуальным исследовать возможность осуществления взаимодействия между ЦНС и ИС на молеуклярном уровне через регуляцию экспрессии гена белковыми факторами. Цель данной работы состоит в выявлении и изучении природы и функции белковых трансфакторов, являющихся общими для клеток нервной и иммунной систем и осуществляющих регуляцию экспрессии гена I2 в Тлимфоцитах. Изучить способность выделенных полипептидов к формированию стабильных и специфических комплексов с проксимальным от до 1 п. АР1 со8 и суип. Осуществить анализа Ыконцевых аминокислотных последовательностей полипептидов, общих для клеток нервной и иммунной систем, с последующим поиском гомологий в банке компьютерных данных по первичной структуре белков.