Na,K-АТРаза как рецептор сердечных гликозидов: идентификация сигнального каскада, независимого от внутриклеточных концентраций Na+ и K+

• Автор: Акимова, Ольга Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 203 с. : ил.

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. ,КАТРаза молекулярная структура, механизм

функционирования и регуляция

2.1.1. Структурная организация ИаДАТРазы

2.1.2. Механизм функционирования ,КЛТРазы

2.1.3.Изоферменты ИаДСАТРазы и их свойства

2.1.4. Родь Ыа,КАТРазы в функционировании различных тканей

2.1.5. Механизмы регуляции Ыа,КАТРазы

2.1.5.1. Фосфорилирование Ыа,КАТРазы протенкиназами

2.1.5.2. Взаимодействие Ыа,КАТРазы с другими белками

2.2. Кардиотонические стероиды как модуляторы активности Ыа,КАТРазы
2.2.1. Участки связывания КТС на молекуле асубъединицы ,КАТРазы.
2.2.2. Эндогенные КТС
2.3. Сигнальные каскады, активируемые КТС
2.3.1. Сигнальный каскад, опосредованный повышением
внутриклеточных концентраций Са и Ыа
2.3.2. Сигнальный каскад, независящий от концентрации внутриклеточного Са2 и опосредованный изменением концентрации внутриклеточного
2.3.3. Сигнальные каскады, независящие от соотношения внутриклеточных концентраций Ыа и К
2.3.3.1. Усиление пролиферации клеток под действием низких концентрации КТС
2.3.3.2. Смерть эпителиальных и эндотелиальных клеток под действием КТС
3. Материалы и методы
3.1. Культуры клеток
3.1.1. Эпителиальные клетки линии С7МОСК
3.1.2. Эпителиальные клетки линии Сасо2
3.2. Морфологические и биохимические методы оценки типа клеточной смерти
3.2.1. Фазовоконтрастная микроскопия
3.2.2. Флуоресцентная микроскопия
3.2.3. Нарушение связи клеток с подложкой
3.2.4. Окрашивание МТТ
3.2.5. Определение активности каспазы3
3.3. Методы изучения ионного гомеостаза клеток
3.3.1. Активность ИаДСнасоса
3.3.2. Связывание 3Нуабаина
3.3.3. Содержание обмениваемого внутриклеточного натрия
3.3.4. Измерение внутриклеточного
3.4. Биохимические методы исследования
3.4.1. Измерение содержания ЫАОНЫАОРН и РАОН2 в
3.4.2. Измерение содержания активных форм кислорода в
3.4.3. Определение синтеза РНК и белка
3.4.4. Иммунопреципитация белков с использованием
антител на Ыа,КАТРазу
3.4.5. Измерение концентрации белка методом Брэдфорда
3.4.6. Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле
по методу Лэммли
3.4.7. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле
3.4.8. Вестсрнблот
3.4.9. Идентификация белков методом массспектромстрии
3.5. Реактивы
4. Результаты
4.1. Сравнительный анализ действия различных
кардиотонических стероидов КТС как ингибиторов
,3i и индукторов независимого от и
онкоза эпителиальных клеток линии
4.2. Идентификация сигнального каскада,
вовлеченного в развитии клеточной смерти, вызванной КТС
4.2.1. Роль кальция в развитии смерти клеток под действием
уабаина
4.2.2. Роль , I3 и протеинкиназ в развитии смерти
клеток, вызванной уабаином
4.2.3. Роль активных форм кислорода АФК в индукции
смерти клеток под действием уабаина
4.2.4. Роль белков цитоскслета в индукции смерти клеток под
действием уабаина
4.2.5. Установление роли кавеол в индукции клеточной
смерти под действием уабаина
4.2.6. Роль экспрессии генов v в индукции смерти
клеток под действием уабаина
4.2.7. Роль в развитии смерти клеток под действием
уабаина
4.3. Выявление белков, взаимодействующих с ,
АТРазой
4.4. Идентификация белков, взаимодействующих с
асубъединицей ,3i в ответ на связывание уабаина
5. Обсуждения результатов
5.1. Сравнительный анализ действия КТС
5.2. Идентификация КаКнезависимого
сигнального каскада, запускаемого КТС и приводящего
к смерти эпителиальных клеток
5.2.1. Роль известных сигнальных каскадов, запускаемых
5.2.2. Роль
5.3. Идентификация белков, взаимодействующих с
асубъединицей Ка,КАТРазы
6. Заключение
7. Выводы
8. Список литературы
Список используемых


Антитела на асубъединицу осаждают комплекс этого белка с Иа,КАТРазой из препаратов очищенной Ыа,КАТРазы ректальных желез акулы . Таким образом, можно говорить о третьей субъединице Ыа,КАТРазы, входящей в семейство низкомолекулярных белков, влияющих на чувствительность фермента к переносимым катионам. Кар. В начале х годов была предложена схема ОлберсаПоста, описывающая механизм функционирования Ыа,КАТРазы а. Это схема, согласно которой каталитический цикл Ыа,КАТРазы представляет собой минимум 4х стадийное чередование двух основных конформационных состояний фермента в фосфорилированном и нефосфорилированном состоянии. Изучение отдельных стадий каталитического цикла ,КАТРазы, их сопряженности с транспортом каждого из катионов привело к пониманию механизма транспорта и сопровождалось появлением различных модификаций схемы, представленной на рис. Рисунок 2. Каталитический цикл На,КАТРазы варианты схемы ОлберсаПоста. Е1 и Е2 различные конформационные состояния ,КАТРазы. Важным открытием в понимании механизма переноса ионов через плазматическую мембрану Ыа,КАТРазой явилось обнаружение окклюдированных форм фермента. Было установлено, что на определенных стадиях каталитического цикла ионы и К оказываются недоступными ни с одной из сторон мембраны рис. Б. Ионы, запертые внутри канала, сформированного Ыа,КАТРазой, были названы окклюдированными . Достаточно мало известно о том, какие аминокислоты принимают участие в формировании центров связывания для переносимых ионов. С использованием метода точечного мутагенеза было показано, что важную роль в связывании ионов калия играет 5 , i, . Для взаимодействия ионов как натрия, так и калия, с ,3i необходимо участие 4 и 8, которые, повидимому, участвуют в координации ионов во время их переноса ферментом через плазматическую мембрану i . Гидроксильная группа 4 участвует в связывание ионов внеклеточного натрия и не оказывает никакого влияние на связывание калия . Каталитический цикл ,КАТРазы начинается со связывания трех ионов с ферментом, находящимся в конформации , с цитоплазматической стороны мембраны рис. А. Это состояние ,КАТРазы характеризуется высоким сродством к АТР и ионам со стороны цитоплазмы. После связывания ионов 4 происходит перенос терминального фосфорильного остатка АТР на остаток аспарагиновой кислоты активного центра асубъединицы фермента 9 с образованием ацилфосфатной ковалентной связи . Фосфорилирование фермента сопровождается окклюзией ионов то есть закрыванием калитки с цитоплазматической стороны мембраны. После этого фермент переходит в новое конформационное состояние Ег, что сопровождается открыванием калитки с внеклеточной стороны мембраны. Поскольку в конформации Е2 ,3 характеризуется низким сродством к и высоким к К, то происходит освобождение трех ионов 4 с внеклеточной стороны мембраны и связывание двух ионов внеклеточного К. Это в свою очередь сопровождается окклюзией ионов К. И, наконец, происходит открывание калитки со стороны цитоплазматической мембраны, приводящее к освобождению К в цитоплазму. Последняя стадия является скоростьлимитирующей, но она ускоряется в присутствии высоких концентраций АТР, причем активация достигается лишь за счет связывания а не гидролиза нуклеотида. Обнаружены четыре изоформы асубъединицы Ыа,КАТРазы , 2, 3 и а4 и три изоформы Рсубъединицы i, р2, рЗ, которые кодируются различными генами . V . Гомология в аминокислотной последовательности между отдельными изоформами и а2изоформами субъединицы Ыа,КАТРазы, встречающейся у разных видов, составляет , и более для и аЗизоформ. Гомология же между различными изоформами у одного и того же вида меньше и составляет примерно . Однако между и а4изоформы гомологичны только на , , . Для изоформ асубъединицы характерна избирательная экспрессия в различных органах и тканях взрослой особи, а также смена экспрессии в одной ткани в процессе развития табл. Изоформа обнаружена во всех клетках, эта изоформа является преобладающей во всех сегментах почек и главная е функция заключается в реабсорбции . Ыа,КАТРазы , . ЗИзоформа встречается главным образом в мозге i, . Ыа,КАТРазы а4, обнаруженную в семенниках крысы i, i, .