Агрегация циркулирующих в крови модифицированных липопротеидов низкой плотности. Роль в накоплении внутриклеточного холестерина

• Автор: Мельниченко, Александра Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04, 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль модифицированных ЛНП в развитии атеросклероза

1.2. Модифицированные ЛНП, циркулирующие в крови человека

1.3. Усиление атерогенности модифицированных i vi ЛНП в результате их ассоциации

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Выделение липопротеидов из плазмы крови человека

2.1.2. Получение нативных и циркулирующих

Ф модифицированных липопротеидов из плазмы крови человека
2.1.3. Выделение белых клеток крови человека
2.1.4. Выделение и культивирование клеток интимы аорты человека
2.1.5. Культура макрофагов человека
2.1.6. Инкубация клеток с ЛНП
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение содержания внутриклеточного холестерина
2.2.2. Определение клеточного белка
2.2.3. Определение содержания белка в ЛНП
2.2.4. Определение относительного размера ЛНП метод
флуктуации светопропускания
2.2.5. Приготовление Iмеченых препаратов липопротеидов
2.2.6. Инкубация клеток с меченными ЛНП в экспериментах по изучению их связывания, захвата и деградации
2.2.7. Исследование деградации меченных ЛНП культурами клеток
2.2.8. Исследование ЛНП методом спиновых зондов
2.2.9. Исследование ЛНП методом флуоресцентных зондов и
2.2 Определение продуктов пероксидации липидов в ЛНП
2.2 Определение содержания сиаловой кислоты в ЛНП
2.2 Определение содержания углеводов в ЛИП
2.2 Метод твердофазного иммуноферментного анализа
2.2 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Накопление холестерина гладкомышечными клетками аорты Ф человека и макрофагами при инкубации их с агрегированными и
не агрегированными ЛНП
3.1.1. Спонтанная ассоциация ЛНП вызывает накопление эфиров холестерина в гладкомышечных клетках и макрофагах. Зависимость от размера агрегатов ЛНП
3.1.2. Клеточный метаболизм агрегированных и не агрегированных 1ЛНП
3.1.3. Изучение механизма захвата агрегатов 1ЛНП
3.2. Изучение особенностей структурной организации склонных к агрегации циркулирующих множественно модифицированных
3.2.1. Исследование структуры нативных и цмЛНП с использованием спиновых и флуоресцентных зондов и меток
3.2.2. Исследование структуры нативных и цмЛНП методом иммуноферментного анализа
3.3. Изучение агрегации ЛНП при изменении их сольватной
оболочки
3.3.1. Изучение полиэтиленгликольиндуцированной агрегации ЛНП
3.3.2. Агрегация ЛНП при понижении ионной силы
3.4. Дегликозилирование ЛНП способствует их ассоциации
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Каков механизм агрегации Как зависит эффективность поглощения клеткой частиц ЛНП от их размера Отличается ли клеточный метаболизм агрегатов ЛНП от не агрегированных частиц ЛНП Цели и задачи исследования. Целыо настоящей работы явилось изучение устойчивости к ассоциации циркулирующих в крови человека модифицированных ЛНП, поиск физикохимических изменений в ЛНП, благодаря которым липопротеиды приобретают склонность к ассоциации, изучение механизма накопления липидов в клетках, вызванного ассоциатами ЛНП. Изучить захват и деградацию ассоциатов ЛНП клетками с целыо выявления механизма накопления внутриклеточного холестерина. Изучить особенности структурной организации склонных к агрегации ЛНП, используя метод спиновых и флуоресцентных меток и зондов, а также панель моноклональных антител к апоВ0. Изучить устойчивость ЛНП к ассоциации при изменении сольватной оболочки и при дегликозилировании. Одним из наиболее ранних проявлений атеросклеротического поражения является внутриклеточное и внеклеточное отложение липидов, преимущественно эфиров холестерина, в интиме сосудов Аничков, i, , , . Образование наполненных липидными включениями пенистых клеток является инициирующим моментом патогенеза атеросклероза, однако, механизмы накопления внутриклеточных липидов изучены недостаточно. Было установлено, что источником липидов, накапливающихся в клетках сосудов, являются ЛНП, циркулирующие в крови человека . , , i . , i . Частица ЛНП состоит из гидрофобного ядра, которое покрыто оболочкой из фосфолипидов, холестерина и одной молекулы апоВ0. Каждая частица ЛНП содержит примерно молекул этерифицированного холестерина, 0 молекул фосфолипидов, 0 молекул неэтерифицированного холестерина и 0 молекул триглицеридов . Фосфолипиды представлены главным образом фосфатидилхолином 0 молекул и сфингомиелнном 0 молекул. Установлено, что апоВ0 связывается в основном с молекулами фосфатидилхолина ii. . . . . Было показано, что инкубация нативных ЛНП с различными типами клеток не приводит к накоплению липидов . . . Причиной служит то, что они попадают в клетку через специфические ЛНПрецепторы, которые обладают механизмом отрицательной обратной связи i , . Это дает возможность клетке регулировать ее внутриклеточное содержание холестерина. ЛНПрецепторов, было показано, что липопротеиды низкой плотности все же попадают в клетки и накапливаются, образуя пенистые клетки. В поиске альтернативных рецепторов Браун и Гольдштейн i . ЛНП или скэвенджеррецептор, через который осуществляется неконтролируемый захват ЛНП клетками. Позднее было показано, что ацетилЛНПрецептор один из многих так называемых скэвенджеррецепторов, присутствующих у макрофагов и других типов клеток i . Скэвенджеррецепторы к ацетилированным ЛИП подразделяются на А1 и А2 . Известно также, что другие рецепторы, такие как , , 1 и X1, проявляют те же свойства, что и скэвенджеррецепторы i. Семейная гиперхолестеринемия достаточно редкое заболевание. В гомозиготной форме им болеет 1 человек на миллион, в гетерозиготной 1 человек на 0 тысяч. Атеросклероз же наблюдается у каждого мужчины после сорока лет и у большинства женщин после наступления менопаузы. Следовательно, накопление липидов в интиме сосудов нельзя объяснить наличием скэвенджеррецепторов, так как нативные ЛНП попадают в клетку через специфические апоВ,Ерецепторы, а не через скэвенджеррецепторы . . . Была выдвинута гипотеза о необходимости изменений свойств ЛНП в результате некой химической модификации, обязательной для того, чтобы произошло накопление липидов в клетках. В интиме артерий и кровеносном русле существуют протеолитические и липолитические ферменты, способные модифицировать ЛНП.