Экспрессия клонированного гена поверхностного антигена вируса гепатита в человеке в Escherichia coli

• Автор: Козловская, Татьяна Минаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Рига
• Количество страниц: 131 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Вирус гепатита В, его место в группе

нвУподобных вирусов гепаднавирусов .

2. Структура нвуII

2.1. Вирусные антигены II

2.2. Структура геномной ДНК НВУ.

3. Генноинженерный этап в изучении НВУ

3.1. Клонирование вирусной ДНК

в бактериальных векторах

3.2. Первичная структура генома нву .
4. Экспрессия гена н в бактериальных клетках . .
4.1. Структура
4.2. Иммунологические свойства нв
4.3. Синтез в бактериальных клетках .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Бактерии, плазмидные и фаговые вектора .
2. Фермелты
3. Электрофорез ДНК.
4. Препаративное выделение плазмид
5. Отбор клонов, содержащих рекомбинантные ДНК .
6. Скрининг рекомбинантных плазмид
7. Секвенирование ДНК.
8. Клонирование ДНК V
8.1. Выделение частиц Дейна.
8.2. Получение ДНК v
8.3. Клонирование ДНК V и отбор
рекомбинантных клонов .
9. Конструирование рекомбинантных плазмид
9.1. Рестрикция ДНК и выделение фрагментов
9.2. Выравнивание липких концов ДНК .
9.3. Лигирование
9.4. Коннекторный способ конструирования рекомбинантных плазмид
. Определение бактериальных полипептидов
методом конкурентной иммунопреципитации
. Определение молекулярной массы бактериальных полипептидов иммунопреципитацией белка, меченого i viv метионином.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Клонирование генома v.
2. Конструирование плазмид для экспрессии
гена в .i.
2.1. Конструирование вектора рТК
2.2. Конструирование плазмиды рСМ8, несущей
гибридный ген
2.3. Конструирование плазмиды рСМ7, несущей гибридный ген 6
2.4. Подстановка гибридных генов
и 4 под промотор триптофанового оперона .i
2.5. Конструирование плазмиды рКМЮ, несущей гибридный ген 6
2.6. Подстановка гибридного гена 6 под промотор триптофанового оперона
.i
2.7. Конструирование плазмиды , несущей гибридный ген .
2.8. Конструирование плазмид для прямой
экспрессии гена
3. Иммунологическое определение синтеза
В .i.
3.1. Определение экспрессии гена в .i методом конкурентной
иммунопреципитации .
3.2. Определение экспрессии гена в .i иммунопреципитацией
меченого белка .
3.3. Эффективность синтеза химерных белков,
содержащих
3.4. Эффективность прямой экспрессии гена
в .i.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Основная трудность, как при разработке диагностикумов, так и в производстве вакцины, состоит в том, что единственным источником вируса была и остается плазма крови вирусоносителей, посколь ку пермиссивная система для эффективной репликации нву до сих пор не найдена. По этой же причине до недавнего времени не было достаточных сведений о структуре вирусного генома, а репликация вируса и в настоящее время остается практически не изученной. Положение резко изменилось в связи с привлечением методов генетической инженерии к исследованиям круга проблем, связанных с вирусом гепатита В. Клонирование и секвенирование ДНК нву привело к локализации генов известных к тому времени вирусных антигенов и, в первую очередь, гена поверхностного антигена нв основного белка оболочки, ответственного за антигенные свойства вирусной частицы. Это позволило надеяться на создание массового источника НВбА в результате высокоэффективной экспрессии гена нв в гетерологичных системах бактериях и дрожжах. В это время успешно решались проблемы экспрессии клонированных эукариотных генов в клетках прокариотов, в результате чего были созданы предпосылки для бактериального производства таких белков как инсулин, интерферон, гормон роста человека б9. Специальные приемы позволили, тем не менее, добиться высоких выходов белка оболочки вируса ящура ю и гемагглютинина гриппа . Очевидно, синтез подобных белков токсичен ДЛЯ ii i, что и стало причиной относительных неудач при экспрессии гена в бактериальных клетках. Целью настоящей работы является подробное и систематическое исследование возможностей экспрессии гена в бактериях. Для этого предпринято клонирование генома V с локализацией гена и конструирование целого ряда плазмид для экспрессии последнего в . концевыми бактериальными участками б с неполным, лишенным гидрофобной концевой части геном , также с концевыми бактериальными участками различной длины. Вовторых, сконструирована серия плазмид, отличающихся структурой участка инициации трансляции, для прямой экспрессии гена . Выбор оптимальной конструкции как для прямой экспрессии гена, так и среди гибридных генов, помещенных под контроль различных по силе промоторов, производился с помощью специально разработанного радиоиммунологического метода, позволяющего количественно оценить синтез полипептидов бактериальной клеткой. Полученные результаты указывают на принципиальную осуществимость бактериального синтеза иммунологически активных вариантов , которые могут быть использованы как в теоретическом плане для изучения антигенной структуры белка, так и в прикладном для иммунодиагностических целей и, возможно, для создания противогепатитной вакцины нового типа. Несмотря на то, что предположение об инфекционной природе гепатита В было высказано С. П.Боткиным еще в г, возбудитель заболевания, вирус гепатита В v, был открыт лишь в г 2 Это сферические частицы диаметром нм, получившие название частиц Дейна по фамилии описавшего их автора. Вирус гепатита В был первым из семейства ДНКсодержащих вирусов, получившего впоследствии наименование гепаднавирусов i. В настоящее время к этой группе относят также вирус гепатита сусликов v , вирус гепатита сурков V , и вирус гепатита В уток v . Вирусы млекопитающих V, V, V не только обладают структурным сходством это сферические частицы от до нм, но и проявляют перекрестную иммунологическую реактивность, обусловленную сходством их поверхностных антигенов , . Для гепаднавирусов характерны такие общие черты как ограниченный круг хозяев и отсутствие надежных систем для репликации i vi, v, например, помимо человека, заражает исключительно высших обезьян, а поиски пермиссивной системы для его репликации заканчивались, как правило, неудачей. Правда,, в самое последнее время появилось сообщение о том, что в культуре лимфобластоидных клеток человека возможна репродукция v . Репликация гепаднавирусов малоизучена. О предполагаемом механизме этого процесса можно судить лишь на основании данных, полученных для V ,2. Вполне вероятно, что при репликации v образуется плюсцепь вирусной РНК полной длины, т.