Функционально важные участки Rpn4 - активатора транскрипции протеасомных генов

• Автор: Карпов, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

1.1.1. Иммунопротеасома.

1.1.2. Разнообразие регуляторных комплексов протеасом

1.1.3. Внутриклеточная локализация протеасом.

1.1.4. Сборка протеасом

1.2. Система убиквитинирования белков

1.2.1. Убиквигин и ферменты системы убиквитинирования

1.2.2. Деубиквитииирование.

1.2.3. Механизмы распознавания белковых субстратов.

1.2.3.1. концсвои аминокислотный остаток концевое правило деградации.

1.2.3.2. Сигнальные последовательности

1.2.3.3. Роль фосфорилирования в узнавании белков системой убиквитинирования

1.2.3.4. Деградация белков с нарушенной третичной структурой.
1.2.3.5. Маскирование сигналов протсолиза.
1.2.3.6. Узнавание субстратов i I
1.3. Протсолитичсские функции УПС
1.3.1. Полное расщепление белковых субстратов
1.3.1 Л. Регуляция активности белков
1.3.1.2. Система деградации белков эндонлазматического рстикулума.
1.3.1.3. Деградация новосинтезированных иолипептидных цепей
1.3.1.4. Образование антигенных олигопептидов.
1.3.2. Процессинг полипептидов путем ограниченного прогеолиза.
1.4. Не протсолитичсские функции компонентов убиквитинпротеасо.мной системы
1.4.1. Везикулярный транспорт
1.4.2. Гистоновый код
1.4.3. Репарация ДИК.
1.4.4. Регуляция активности транскрипционных факторов путем моноубиквитинировапия
1.4.5. Привлечение иротеасомных субъединиц к активно транскрибируемым генам.
II. Регуляция экспрессии протсасомных генов у эукариот
2.1. Система регуляции транскрипции протсасомных генов у
vii
2.1.1. РАСЕ
2.1.2 Выяснение роли 4 и его характеристика
2.1.3. Механизмы деградации
2.1.4. Модель регуляции протеасомных генов по принципу отрицательной обратной связи
2.2. РАСЕ и гомологи 4 у дрожжей подкласса i.
2.3. Регуляция транскрипции протеасомных генов у высших эукариот.
1. Структура эукариотических трансактиваторов.
3.1. ДНКсвязывающие домены.
3.1.1. ДНКсвязывающие домены, содержащие мотив спиральнетляспираль.
3.1.2. ДНКсвязывающие домены, содержащие цинк цинковые пальцы.
3.1.2.1. цинковые пальцы С2Н
3.1.2.2. Семейство рецепторов гормонов.
3.1.2.3. ДНКсвязывающие домены с мотивом петляслоЙспираль.
3.1.2.4. Семейство
3.1.3. ДНКсвязывающие домены факторов, содержащих лейциновую застежку.
3 . 1 . 3. 1 . Семейство факторов с лейциновой
застежкой.
3.1.3.2. Семейство факторов с мотивом спиральпетляспираль.
3.1.4. Белки с слойным ДНКсвязывающим доменом.
3.2. Трансактиваторныс домены.
3.2.1. Кислые трансактива горные домены
3.2.2. Глутаминбогагые трансактиваторные домены.
3.2.3. Пролинбогатые трансактиваторныс домены.
3.2.4. Серинтреониновые трансактиваторные домены .
3.3. Сигналы ядерной локализации
Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы.
1. Получение плазмидиых конструкций.
2. ПЦРмутагенез
3. Выделение 4 из . i
4. Трансформация нативных клеток 5. сегеУ1я1ае плазмидной ДНК.
5. Выделение геномной ДНК 5.
6. Выделение суммарной РНК из дрожжей
7. Лгарозноформальдсгидный электрофорез РНК
8. Синтез кДНК.
9. Полуколичественная ПЦР
. ПЦР в реальном времени.
. Метод выращивания серии разведений дрожжевой культуры на чашках Петри
. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии
. Вестсрнблоттинг.
. Метод формальдегидпой фиксации и иммунопреципитации хроматина
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Крп4р позитивный и негативный транскрипционный регулятор убиквитинпротеасомной системы.
2. Анализ Сконцевой области Крп4р.
3. Анализ центральной части рп4р.
4. Анализ. Нконцевой области Крп4р
5. Мутационный анализ Ыконневого трансактиваторного домена
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Она состоит из комплекса ферментов, осуществляющих узнавание белковых субстратов и ковалентное присоединение к ним полиубиквитина, и крупного протеазного комплекса протеасомы, который узнает полиубиквитинированные белки и расщепляет их до олигопептидов. Да. Протеолитический комплекс массой около 0 кДа образует центральнаую часть протеасомы и представляет собой полый цилиндр длиной нм и диаметром нм . Этот комплекс осуществляет расщепление белковых субстратов x . К протеасоме примыкают по бокам два комплекса массой более 0 кДа, которые необходимы для активации протеасомы, узнавания субстратов и подготовки их к расщеплению. Рисунок 1. Модель структуры протеасомы. По данным рентгеноструктурного анализа прогеолитический комплекс образован из четырех колец, каждое из которых сложено из семи различных субъединиц массой от до кДа . Канал внутри цилиндра имеет три расширения камеры большую центральную, где осуществляется протеолиз полипептидов, и две боковые меньшего размера x . Диаметр выходных отверстий канала составляет менее 1,5 А, что немного больше диаметра аспирали полипептидной цепи 1,1 А. Таким образом, осуществляемый протеасомой протеолиз является пространственно изолированным процессом . В ранних исследованиях протеасома была охарактеризована как комплекс с мультипептидазной активностью i i, . Протеолитические субъединицы протеасомы также способны к расщеплению полипептидной цепи после остатков разветвленных аминокислот и между небольшими нейтральными аминокислотами i, . I I, iv . Ферменты, коицевые аминокислотные остатки которых участвуют в акте катализа, объединяют в группу, называемую гидролизами с концевыми нуклеофилами i i i . Комплекс состоит, не менее чем, из различных белков с массой от до 0 кДа. Его компоненты образуют два структурно и функционально различимых субкомплекса основание и крышку рис. В состав субкомплскса основания, примыкающего к ядру, входят 3 субъединицы, не обладающие ЛТФазиой активностью 1, 2, , и 6 АТФаз ЛАЛ семейства . Если говорить о функциях неАТФазпых субъединиц субкомплскса, то известно, что обеспечивает ассоциацию субкомплсксов крышки и основания i . За эту функцию отвечает концсвая область белка i . Сконцевая область содержит домен, связывающий убиквитин i , , что позволяет белку быть рецептором полиубиквитинированных субстратов протеасомы. Наибольшим сродством Юр обладает к цепи из четырех звеньев убиквитина, которая является маркером деградации i , . Нужно отметить, что единственный протеасомпый белок, который обнаруживается в больших количествах в свободном состоянии, не связанным с прогсасомой v, v . Деления гена у дрожжей не детальна. Протеасомы, выделенные из таких мутантов имеют слабую связь между субкомплексами крышка и основание, но сохраняют, хотя и хуже способность связывать и расщеплять полиубиквитииированные белки. Это означает, что и другие субъединицы в составе протеасомы могут узнавать цени полиубиквитина. Действительно, методом сшивок показано, что полиубиквитиновая цепь контактирует также с АТФазой 5, причем взаимодействие сопряжено с гидролизом АТФ . Основной функцией АТФаз регуляторного комплекса является участие в энергозависимых процессах разворачивания лолипептидной цепи и ее транслокации внутрь ядра i . Субкомплекс крышки образуют 8 субъединиц 3, 5, 6, 7, 8, 9, , , , которые не обладают АТФазной активностью. Полагают, что структурная целостность субкомплекса обеспечивается взаимодействиями между его субъединицами посредством доменов, называемых I и . Подобные домены описаны у других эукариотических белков, обнаруженных, например, в факторе инициации трансляции I3 и комплексе СОР9 i vi i, i . Внесение мутаций в эти домены у протеасомных субъединиц нарушает целостность реляторного комплекса . I домен обнаружен в Сконцевой области 3, 5, 6, 7, 9 и , он имеет длину около 0 аминокислотных остатков и состоит в основном из аспиралей. Известно, что субкомплекс крышки участвует также в узнавании и подготовке к деградации убиквитинированных субстратов, однако эти активности пока не локализованы i . Рисунок 2. Схема структуры регуляторного комплекса.