Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека

• Автор: Пискарева, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 102 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА Г ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация генома человека и мобильные элементы.

1.2. Строение и механизмы транспозиции мобильных элементов генома человека.

1.2.1. Транспозоны

1.2.2. содержащие ретротранспозоны

1.2.3. несодержащие ретро граиспозоны.

1.2.4. I.

1.3. Жизненный цикл несодержащего регротранепозона 1.

1.3.1. Транскрипция.
I 3.2.1 роцессинг
1.3.3. Трансляция
1.3.4. Белок ОРТ.
1.3.5. Белок ОРТ2.
1.3.6. Пос трансляционные модификации белков и образование рибонуклеопротеинового комплекса
1.3.7. Доставка в ядро
1.3 8. Интеграция в геномную дик
1.4. Образование инверсий и делений элемента I.
1.5. Образование укороченных копий I.
1.6. Перемещение элементов 1.1 по геномной ДНК
1.6.1. Гомологичная рекомбинация
1.6.2. Транспозиционная активность элементов 1,1.
1.6.3. Частота транспозиций элементов Ы
1.7. Клеточные функции элемента Ы .
1.7.1. Влияние на экспрессию генов.
1.7.2. Восстановление двухцепочечных разрывов ДК.
1.7.3. Реорганизация генома
1.8. Практическое применение элементов Ы.
1 Филогенетические маркеры.
1.8.2. Система случайного мутагенеза.
1.8.3. Вектор для переноса генов.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и реактивы
2 Реактивы
2.1.2. Штаммы Н.соИ и культуры клеток
2.1.3. Вектора
2.1.4. Олигонуклеотиды.
2 1.5. Основные буферы и растворы
2.1.6. Бактериальные среды.
2.2. Методы рекомбинантных дик.
2.3. Клонирование и экспрессия ОРТ1 и фрагмента ОРТ2 элемента ЫН в клетках .со
2.4. Выделение и очитка рекомбинантных белков из клеток .со.
2.5. Получение поликлональных мышиных антител
2.6. Клонирование и экспрессия ОРТ2 элемента 1,1л, кодирующей обратную транскриптазу в клетках насекомых 5Г.
2.6.1. олучение рекомбинантной бакмиды, несущей ОРТ2 Ь1 л.
2.6.2. Получение рекомбинантного бакуловируса,
несущего ОРТ2 ЬI Ал.
2.6.3. Определение титра рекомбинантного бакуловируса
2.6.4. Наращивание и хранение рекомбинантного бакуловируса
2.6.5. Экспрессия ОРТ2 элемента Ы Ал в клетках насекомых
2.7. Выделение рекомбинантной ОТ элемента Ы из клеток
насекомых БГ.
2.8 Конструирование и экспрессия элемента ЫАх
в клетках млекопитающих .
2.9. Культивирование клеток эукариот
2 Выделение ядер клеток млекопитающих
2. II. Аналитические методы
21. РНКзависимая ДНКполимеразная реакция
22. Получение гетерогенных матриц.
23. Реакция элонгации праймера.
2. 4. Определение активности РНКазы .
25. Гельэлектрофорез НК в денатурирующих условиях
26. 8элекчрофорсз белков
27. Окрашивание белковых гелей ни1фатом серебра.
28. Иммуноблотинг
29. Определение концентрации белка.
2 Микроскопия.
21. Световая микроскопия.
22. Флюоресцентная микроскопия.
23. Конфокальная микроскопия
24. Трансмиссионная электронная микроскопия.
Г ЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Экспрессия гибридных белкой элемента 1 i с целью получения поликлональных антител.
3.2. Экспрессия белка ОРТ2 элемента Ул в клетках насекомых I2I .
3.3. олучсние препарата обратной транскрипгазы элемента I
3.4. Оптимумы ДЫКполимеразной активности
обратной транскриптазы элемента 1
3.5 Влияние двухвалентных катионов
на активность ОТ элемента Ул
3.6. Специфичность к субстратам ОТ элемента I л.
3.7. Синтез ДНК ОТ элемента I
3.8. Активность РГГКазы ОТ элемента I .
3.9. Локализация белка р элемента I в клетках млекопитающих .
3.9.1. В клетках человека линии белок р
накапливается в цитоплазме
3.9.2. В клетках хомяка I т viv белок р элемента I накапливается в цитоплазме.
3 Образование вирусоподобных частиц белками элемента I
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


несодержащие ретро граиспозоны. I. Жизненный цикл несодержащего регротранепозона 1. Транскрипция. I 3. Белок ОРТ. Белок ОРТ2. Образование инверсий и делений элемента I. Образование укороченных копий I. Перемещение элементов 1. Транспозиционная активность элементов 1,1. Клеточные функции элемента Ы . Влияние на экспрессию генов. Восстановление двухцепочечных разрывов ДК. Практическое применение элементов Ы. Филогенетические маркеры. Система случайного мутагенеза. Вектор для переноса генов. ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Штаммы Н. Олигонуклеотиды. Бактериальные среды. Методы рекомбинантных дик. Клонирование и экспрессия ОРТ1 и фрагмента ОРТ2 элемента ЫН в клетках . Выделение и очитка рекомбинантных белков из клеток . Клонирование и экспрессия ОРТ2 элемента 1,1л, кодирующей обратную транскриптазу в клетках насекомых 5Г. ОРТ2 Ь1 л. ОРТ2 ЬI Ал. БГ. II. Получение гетерогенных матриц. Реакция элонгации праймера. Определение активности РНКазы . Окрашивание белковых гелей ни1фатом серебра. Определение концентрации белка. Микроскопия. Световая микроскопия. Флюоресцентная микроскопия. Трансмиссионная электронная микроскопия. Г ЛАВА 3. Экспрессия гибридных белкой элемента 1 i с целью получения поликлональных антител. Экспрессия белка ОРТ2 элемента Ул в клетках насекомых I2I . Специфичность к субстратам ОТ элемента I л. Активность РГГКазы ОТ элемента I . Локализация белка р элемента I в клетках млекопитающих . В клетках хомяка I т viv белок р элемента I накапливается в цитоплазме. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. БЛАГОДАРНОСТИ . глютатионБтрансфераза. Элементы I или I1 относятся к классу ретротранспозонов, не содержащих длинные концевые повторы , и составляют приблизительно генома человека. Элементы этого класса реинтегрируют в геном через РИКпосредник при участии собственной обратной транскриптазы. В основном элементы I генома человека . I. К настоящему времени клонированы полноразмерные активные копии и определены их структурные особенности i П. Именно активные . Консенсусная последовательность 1. ОРТ. ., , II. При изучении транспозиционной активности I. С концевая область белка р содержит ряд консервативных аминокислот важных для транспозиции элемента I . Кроме того, было обнаружено цисактивное функционирование Ул в процессе реинтеграции в геном , , , i, , i . И двух независимых экспериментах было показано, что активность ОТ свойственна центральному домену белка ОРТ2, хотя другие выдвинутые предположения спорны, поскольку исследования проводились на частично очищенном препарате белка ОРТ2 . i О. С помощью генетического метода определения частоты событий ретротранспозиции было показано, что делении и мутации в последовательности ОРТ2 Л приводят к инактивации транспозиционной активности элемента в культуре клеток человека . Недавно было показано, что интеграция элемента человека I в геном обеспечивается активностью обратной ранскриптазь белка ОРТ2, причем в качестве праймера для построения кДНК используется Звысгуиающий конец сайта мишени геномной ДНК . Такой механизм впервые был описан для несодержащего ретротрансиозона 2 Нт и получил название обратная транскрипция, праймированая сайтоммишенью . Таким образом, именно активность обратной гранскрипгазы является одним из важнейших факторов, определяющим возможность построения кДНК копии элемента и его дальнейшее встраивания в геном. Совокупность имеющихся данных, касающихся молекулярной биологии Л, оставляет открытыми ряд важных вопросов, решение которых является актуальным. В частности плохо изучены функциональные и структурные свойства белка ОРТ2 Л, так же как и особенности процесса, катализируемого этим ферментом, изза отсутствия гомогенного и стабильного препарата фермента. Так же остается неясной рол р в транспозиции I Л. Кроме того, не выяснен механизм взаимодействия белков и РНК элемента в процессе доставки матрицы в ядро.