Изучение противовирусного действия антисмысловых РНК, направленных против 3-концевой области генома вируса лейкоза коров

• Автор: Терновой, Владимир Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Принятые сокращения.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антисмысловые РНК общая характеристика.

1.1.1. Природные антисмысловые РНК у прокариот.

1.1.2. Природные антисмысловые РНК у эукариот.

1.2. Рекомбинантные антисмысловые гены

1.2.1. Факторы, определяющие эффективность искусственных антнсмысловых енов в эукариотических клетках

1.2.1.1. Транскрипция ангисмысловот гена

1.2.1.2. Солокализация молекул асРНК и РНКмишени.

1.3. Ретровирусы
1.3.1. Жизненный цикл ретровирусов
1.3.2. Роль белка ВИЧ1 в регуляции синтеза вирусных РНК
1.3.3. Регуляция экспрессии ВИЧ1 на посттранскрипциониом уровне.
Регуляторный белок v.
1.3.4. Вирион.
1.3.5. Сингез вирусной ДНК
1.4. Стратегии борьбы с ретровирусной инфекцией при помощи
рекомбинантных генов асРНК
1.4.1. Подавление экспрессии генома ретровируса в инфицированной клетке.
1.4.2. Блокирование интеграции вирусной ДНК с ДНК инфицированной клетки.
1.5. Вирус лейкоза коров
1.5.1. Геном ВЛК и продукты генов.
1.5.2. Экспрессия ВЛК.
1.5.3. Регуляторные белки ВЖ
1.5.4. Патогенез энзоотического лейкоза коров.
1.6. Искусственные антисмысловые гены против генов ВЛК и вируса
Тклеточного лейкоза человека.
1.7. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции
1.8. Регуляторные элементы, обеспечивающие клеточноспецифическую экспрессию трансгсна
1.9. Заключение.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.1.1. Бактериальные штаммы и питательные среды.
2.1.2. Плазмидные векторы.
2.1.3. Ферменты и другие реактивы.
2.1.4. Клеточные линии
2.2. Методы.
2.2.1. Клонирование ДНК.
2.2.2. Приготовление компетентных клеток Е.со и их трансформация препаратами плазмндной ДНК
2.2.3. Выделение плазмидной ДНК.
2.2.4. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами.
2.2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом
электрофореза в агарозном геле
2.2.6. Препаративное выделение фрагментов ДНК и их элюция из геля
2.2.7. Лигирование фрагментов ДНК.
2.2.8. Выделение РНК из клеток
2.2.9. Нозсрнблотгибридизация.
2.2 Приготовление зонда для гибридизации
2.2 Ревертазная реакция и последующий ГТЦР анализ.
2.2 Трансфекция клеточных линии препаратами плазмндной ДНК
2.2 Тест вируенндуцнрованного сннцитисобразовання.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Создание клеточной тестсистемы для изучения действия генов
асРНК на репродукцию ВЛК
3.1.1. Конструирование ретровирусного вектора рВЬУОРР
3.1.2. Конструирование рекомбинантной плазмиды рСМЛахгсх.
3.1.3. Экспрессия генов ВЛК рекомбинантными плазмидами
рВЬУОРР и рСМУ1ахгех в культу ре клеток
3.1.4. Изучение возможности детектировать инфицированные ВЛК клетки при помощи системы регулируемого контроля
экспрессии маркерного гена
3.2. Конструирование генов асРНК на основе фрагментов ЗКонцсвого у частка провнрусной ДК ВЛК и изучение их
противовирусного действия
3.2.1. Создание нлазмидных конструкций и анализ
транскрипции антисмысловых генов
3.2.2. Изучение сравнительной противовирусной активности рекомбинантных антисмысловых генов.
3.2.3. Создание плазмидной конструкции, несущей
рекомбинантный антнсмысловой ген с сигналом упаковки ВЛК
3.2.4. Ингибирование репродукции ВЖ геном, кодирующим асРНК с сигналом упаковки ВЛК
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ОГЛАВЛЕНИЕ. Принятые сокращения. Глава 1. Антисмысловые РНК общая характеристика. Природные антисмысловые РНК у прокариот. Природные антисмысловые РНК у эукариот. Солокализация молекул асРНК и РНКмишени. Регуляция экспрессии ВИЧ1 на посттранскрипциониом уровне. Регуляторный белок v. Вирион. Подавление экспрессии генома ретровируса в инфицированной клетке. Блокирование интеграции вирусной ДНК с ДНК инфицированной клетки. Геном ВЛК и продукты генов. Экспрессия ВЛК. Патогенез энзоотического лейкоза коров. Тклеточного лейкоза человека. Заключение. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Бактериальные штаммы и питательные среды. Плазмидные векторы. Ферменты и другие реактивы. Методы. Клонирование ДНК. Приготовление компетентных клеток Е. Выделение плазмидной ДНК. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами. Лигирование фрагментов ДНК. Нозсрнблотгибридизация. Ревертазная реакция и последующий ГТЦР анализ. Тест вируенндуцнрованного сннцитисобразовання. Глава 3. Конструирование рекомбинантной плазмиды рСМЛахгсх. Изучение сравнительной противовирусной активности рекомбинантных антисмысловых генов. Глава 4. ВЫВОДЫ. Принятые сокращения. Актуальность проблемы. Вирус лейкоза коров экзогенный лимфотропный ретровирус, заражающий в естественных условиях крупный рогатый скот. У значительной части инфицированных животных развиваются патологические процессы, снижающие их продуктивность, а так как уровень инфицированности домашнего скота высок более поголовья стада молочных коров в развитых странах, экономические потери оцениваются десятками миллионов долларов v,. Гены ВЛК, обеспечивающие сто репродуктивный успех и дестабилизирующие гомеостаз инфицированной клетки, установлены. Это дает возможность использовать антисмысловыс гены для контроля экспрессии вирусного генома. Создание антиВЛК генов асРНК. ВЛК. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение возможности ингибирования репродукции вируса лейкоза коров при помощи генов асРНК против 3концевой области вирусного генома. Создать клеточную тестсистему, позволяющую в короткие сроки надежно детектировать инфицированные вирусом лейкоза коров клетки. Создать на основе фрагментов Зконцсвого участка провирусной ДНК ВЛК серию рекомбинантных плазмид, несущих антисмысловме гены. Изучить сравнительную противовирусную активность ашисмысловых генов в клетках линии СС при помощи теста подавления внрусиндуцированного с и нцитисобразовани я.