Изучение роли антикогена р53 в механизме устойчивости клеток к трансформации онкогеном ras

• Автор: Иванов, Алексей Валентинович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 153 с. : ил.

1.1 БИОЛОГИЧЕСКИЕ АКТИВНОСТИ АНТИОНКОГЕНА

1.1.1. Структура белка р.

1.1.2. Транскрипционные мишени белка р.

1.1.2.1. Гены, активация которых способствует замедлению клеточного цикла.

1.1 2.2. Гены, участвующие в рзависнмом апогтгозе

1.1 2.3. Гены, кодирующие ингибиторы ангиогенеза и другие секретнруемые факторы.

1.1.3 Латентное и активированное состояние белка р

1.1.4. Активация р в ответ на стрессы.

1.2. ДОМИНАНТНЫЙ ОНКОГЕН

1.2.1 Структура и биохимические свойства

1.2.2 Эффекторы .

1.2 3 Эффекторы МАРК каскад и транскрипционные факторы
1.2.4 индуцированиая трансформация клеток линий нмморталкзованных фнбробластов грызунов.
1.3. КООПЕРАЦИЯ ОНКОГЕНОВ И АКТИВАЦИЯ Р ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ
1.4. СИСТЕМА ТЕТРАЦИКЛИНРЕГУЛИРУЕМОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клеточные линии и их культивирование.
2.2. Лизис клеток к приготовление ядерных экстрактов
2 3. Измерение концентрации белка но методу Бредфорд
2.4. Пульсовое мечение белка метионином и иммунопреципитация
2.5. Фракционирование белков в полиакриламидном геле
2.6. Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетскция
2.7. Получение компететгных клеток Е.соП и трансформация
2.8. Препаративное и аналитическое выделение плазммдной ДНК.
2.9. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами.
2. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.
2 Реакция лигирования.
2. Конструирование ретровирусных векторов.
2 ПЦР при конструировании ретровирусных векторов.
2. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструктов методом
кальцийфосфатной преципитации.
2. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами и селекция на
антибиотике устойчивых культур
2 Диализ распределения клеток по клеточному циклу.
2. Выделение РНК из эукариотических клеток, ОТПЦРаналнз и
ссквснированме к ДНК р
2. Диализ активности хлорамфеннколаиетилтрансферазы СЛТреакция
2 Количественное определение флуоресценции зеленого белка ЕОРР
2. Хромосомный анализ.
2. Изучение способности клеток входить в Яфазу клеточного цикла по
включению ими 5бромдсзоксиуридина
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Анализ способности различных клеточных культур трансформироваться под
действием онкогена в зависимости от состояния в них сигнального пути.
ведущего к активации р.
3.2 Исследование эффективности трансформации и экспрессии белка р в
клетках . при введении кооперируют их онкогенов туе и
3.3 Анализ конформационного состояния и функциональной активности белка
р в контрольных и трансформированных онкогенами туе клетках
3.4. Генетический анализ изменений в гене р в трансформированных онкогенами
клетках
3.5. Создание и характеристика высокоэффективной ретровирусной системы для
тетрацнклинрегулнруемой экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих.
3 6. Получение различных линий клеток с тетраииклннрегулирусмой экспрессией онкогена и изучение кинетики активации белка р под действием онкогена
в клетках
3.7. Изучение влияния онкогена на частоту возникновения спонтанных
генетических нарушений в клетках с различным состоянием р.эявиснмого
сигнального пути.
4. ВЫВОДЫ
5. БЛАГОДАРНОСТИ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
А о аминокислотный остаток
БСА бычий сывороточный альбумин
БФС бромфеноловый синий
ДТТ днтиотрейтол
ПЛАТ полиакриламидный гель
ОТ обратная транскрипция
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полнэтнленгликоль
ЭДТА этилсндиаминтетрауксусная кислота
БОБ додецнлеульфат натрия
НЕРЕБ М2гидроксютюенпиперазинК2зтансульфоновая кислота
ТВР ТАТАсвязывающий белок
МБ сигнал ядерной локализации
РВБ фосфатносолевой буфер
РСА ядерный антиген пролиферирующих клеток
Ч р белок р дикого типа
САТ хлорамфениколацетнл грансфераза
ИО ионизирующее облучение
УФ ультафиолетовое облучение
ВВЕДЕНИЕ


С одной стороны, почти каждая аминокислота этого домена с той или иной частотой может мутировать в опухолях и давать белок с нарушенной активностью Тот факт что любые изменения структуры данного участка приводят к нарушению функции белка свидетельствует об исключительной хрупкости конформации р, которая определяется именно центральной частью молекулы. С другой стороны, в центральном участке р выявлены горячие точки, по которым мутации происходят с повышенной частотой. Ренгеноструктурный анализ комплекса ДНК с ДНКсвязываюшнм доменом р указывает на то. ДНК . Хрупкость конформации ДНКсвязывающсго домена р отражается и в изменении антигенных эпитопов. РАЬ0 . Данная пара моноклональных антител является важным диагностическим инструментом, позволяющим регистрировать изменения конформации не только мутантного белка, но и неповрежденного р, находящегося в различных физиологических состояниях i ,
Лннкериын участок между аминокислотами 5 и 3 ответствен за ядерную локализацию белка р i . Участок, ответственный за тетрамеризацию молекул р расположен между аминокислотами 3 и 6. Он имеет выраженную аспиральную структуру . Утрата способности к олигомеризации при нарушении альфаспирального домена приводит к функциональной инактивации р , , i i. Молекулы р с инактивирующими мутациями в ДНКсвязывающем домене также способны образовывать тетрамерные комплексы за счет аспирального домена Гибридный комплекс между белком дикого типа и мутантом неактивен Этим объясняется трансдоминакгный доминантнонегативный характер мнссенсмугацнй гена р vi, . Непосредственно на Сконцс молекулы аминокислоты расположен щелочной домен, играющий важную роль в регуляции активности р. Этот домен является мишенью для целого ряда модифицирующих ферментов. В модифицированном состоянии щелочной домен препятствует образованию комплекса между ДНК и центральным ДНКсвязываюшим доменом р. В этом случае молекула р находтся в латентном состоянии Удаление щелочного домена протеолкзом приводит к стимуляции ДНКсвязывающей активности р i vi . Такой же эффект наблюдается при обработке р моноклональными антителами РАЬ1, узнающими участок Сконцевого домена V, , а также при добавлении синтетических пептидов, соответствующих этой же области р . Сконцевого и центрального доменов р. Сконцевой домен играет мсключглгельно важную роль в регуляции активности р i viv. Модификация этого участка киназами, ацетилазами, гликозилазами, а также взаимодействие с другими белками приводит к изменению ДНКсвязывающей и трансактивационном способности р. Кроме того, Сконцевой домен р обладает способностью неспецифически связываться с участками одноцепочеченой ДНК, неспаренными основаниями и концами ДНК i . ДИК. Основными последствиями активации р в клетках являются задержка прохождения по клеточному циклу и апоптоз Однако биологические эффекты р не ограничиваются этими двумя процессами, поскольку сейчас уже ясно, что р может играть роль в процессах репарации ДНК, участвовать в некоторых важных внутриклеточных процессах, например в контроле репликации центросом . Гатегоп, Оатегоп, v Е. Несомненно, что список активностей р со временем будет продолжен. Транскрипционные мишени бедка р. Транскрипционная репрессия является функцией Сконцевой части молекулы р i i . ТВР ТАТАx ii i . ТИШ и 1II i i, . Тем самым частично подавляется активность Р1ГК полимеразы II и РНКполнмсразы Ш. Кроме того. ЭСТрОгеновын рецептор и транскрипционный фактор 5 i . В результате способен репрессировать транскрипцию большого числа генов, среди которых гены Вс ii, и vi. МЛР4 и ген 9 . Большая часть сведений о механизмах р3индуиирумых процессов была получена путем идентификации эффскторных генов, экспрессия которых повышается под действием р Помимо гена 2, осуществляющего негативную регуляцию р. Гены, активации которых способствует замедлению клеточного никла. Основным эффекторным геном р является белок Л,1С1, ИС1Ш, ЯВЛЯЮЩИЙСЯ универсальным ингибитором циклинзависимых киназ i, . ДНК . Кроме того, р связывается с ядерным антигеном пролиферирующих клеток и, таким образом, может уменьшать процесснвность ДНКполимеразы, что, возможно, приводит к переключению репликативною синтеза на преимущественно рспаративный . Известны уже три рреспонсивных гена, участвующих в остановке клеток в фазе 2 клеточного цикла Продукт гена . РСКА i . Кроме того, он связывается и ингибирует комплекс циклнн 2.