Молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика вируса лихорадки долины рифт и создание тест-систем для диагностики этой инфекции

• Автор: Белов, Артем Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ стр.

Список сокращений.

Введение

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эпидемиология ЛДР.

2. Клиника, патогенез ЛДР

3. Систематическое положение, морфология, молекулярнобиологическая характеристика ВЛДР

4. Молекулярные аспекты эволюции и филогенетика ВЛДР.

5. Лабораторная диагностика ЛДР

6. Профилактика и лечение ЛДР

Заключение по обзору литературы

И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 1. Материалы и методы
1.1. Вирусы, клеточные культуры, лабораторные животные, препараты
1.2. Методы исследования
1.2.1. Реакция нейтрализации.
1.2.2. Непрямой метод флуоресцирующих антител МФА
1.2.3. Метод бляшкообразования.
1.2.4. Получение антигенов вируса ЛДР
1.2.5. Получение гипериммунной асцитной жидкости к ВЛДР.
1.2.6. Выделение специфических вантител на
протеин Асефарозе.
1.2.7. Конъюгирование специфических вантител с пероксидазой хрена.
1.2.8. ИФА для выявления специфического антигена ВЛДР
1.2.9. Выделение РНК вируса ЛДР из различных образцов
1.2 Проведение ОТПЦР и ОТПЦР в реальном времени
для выявления РНК вируса ЛДР
1.2 Анализ результатов ОТПЦР и ОТПЦР в реальном времени.
1.2 Конструирование генноинженерного положительного контроля
1.2 Определение первичной нуклеотидной последовательности гена В ЛДР.
1.2 Построение филогенетического дерева.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 2. Культивирование и идентификация штамма
вируса ЛДР .
Глава 3. Филогенетический анализ штамма вируса ЛДР
3.1. Определение полной нуклеотидной последовательности гена вируса ЛДР
3.2. Построение филогенетического дерева .
3.3. Определение различий в антигенных детерминантах гена у
близких штаммов В ЛДР.
Глава 4. Разработка тестсистем гнездовой ОТПЦР и ОТПЦР в реальном времени для выявления РНК вируса ЛДР
4.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР
4.2. Определение специфичности ПЦР тестсистем
4.3. Определение чувствительности ПЦР тестсистем.
4.4. Конструирование генноинженерного положительного контроля для тестсистем ПЦР.
Глава 5. Разработка и характеристика тестсистемы ИФА для выявления антигена вируса ЛДР
5.1. Антигены, иммуноглобулины, конъюгаты.
5.2. Определение специфичности метода ИФА
5.3. Определение чувствительности метода ИФА.
Глава 6. Изучение действия рибавирина и его производных на
цитопатогенную активность вируса ЛДР
Обсуждение результатов
Список литературы


Лихорадка долины Рифт ЛДР это зоонозная, особоопасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока. Вирус ЛДР относится к роду РЫеЬочггш семейства Випуачмдае. Он обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных. В эндемичных регионах заболеваемость ЛДР регистрируется в виде спорадических случаев, эпидемических вспышек крупных эпидемий и эпизоотий. У человека болезнь в основном проявляется как гриппоподобная лихорадка и в большинстве случаев заканчивается выздоровлением. Средний уровень летальности составляет приблизительно 3, однако развитие отягченных форм заболевания, сопровождающихся геморрагическим синдромом, некрозом печени и менингоэнцефалитами, приводит к резкому увеличению летальности до . Такие осложненные формы ЛДР наиболее часто наблюдаются во время эпидемий, которым предшествовали эпизоотии среди домашних животных . Лихорадка передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей. По этим причинам, группу наибольшего риска заболевания ЛДР составляют фермеры, ветеринары, пастухи, работники скотобоен и лабораторный персонал, осуществляющий манипуляции с вирусом . Развитие эпизоотий и эпидемий, интервал между которыми составляет несколько лет, связано с выпадением обильных осадков, когда происходит массовое размножение комаров . Крупные эпидемии и эпизоотии былизарегистрированы в ЮАР гг. Египте гг. Мавритании г. Мадагаскаре г. Кении г. Саудовской Аравии и Йемене гг. Египте в годах было зарегистрировано 0 случаев ЛДР с 0 летальными исходами . В Саудовскую Аравию и Йемен, впервые за пределы Африки, вирус распространился, вероятно, с инфицированным домашним скотом из Восточной Африки или был перенесен комарами . Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, так как обуславливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 0 больных животных . Наряду с другими нозологическими формами вирусных геморрагических лихорадок ЛДР относится к категории карантинных инфекций и требует особого внимания к завозу этого заболевания из эндемичных регионов инфицированными лицами. Импорт копытных животных также может быть причиной интродукции вируса ЛДР на неэндемичные территории. Наконец, вирус ЛДР рассматривается наряду с вирусами других геморрагических лихорадок в качестве агента высшей категории А для применения в биотеррористических целях . В связи с вышеперечисленными обстоятельствами разработка и совершенствование методов специфической диагностики и средств лечения ЛДР на основе всестороннего изучения свойств вируса ЛДР представляются актуальными направлениями для науки и практики, учитывая факт отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов. ЛДР. Культивировать и идентифицировать штамм вируса ЛДР из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов. Определить полную нуклеотидную последовательность гена референтного штамма вируса ЛДР. Определить филогенетические связи референтного штамма вируса ЛДР с другими штаммами этого вируса на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена . Разработать тестсистемы гнездового варианта ОТПЦР и ОТПЦР в реальном времени для диагностики ЛДР, отработать условия ПЦР на референтном штамме. Определить чувствительность и специфичность разработанных тестсистем. Сконструировать генноинженерный положительный контроль для использования в тестсистемах ПЦР. Разработать тестсистему ИФА для выявления антигена вируса ЛДР, определить ее чувствительность и специфичность. Сравнить чувствительность ИФА и ПЦР тестсистем. Изучить действие отечественного препарата рибавирин, синтезированного в Институте биоорганической химии с помощью нового биотехнологического метода, и производных данного препарата на цитопатогенную активность вируса ЛДР. Проведены филогенетические исследования референтного штамма вируса ЛДР из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов.