Получение, условия культивирования и свойства теломеризованных клеток мезенхимального происхождения

• Автор: Молдавер, Марианна Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Теломеры человека.

Структура теломер

Образование одноцепочечного Зконца.

Белки, связанные с теломерной ДНК

Нарушение функции теломер

Репликация теломер.

Теломераза человека.

Каталитический компонент теломеразы и регуляция его экспрессии.

РНКкомионент теломеразы.

Сборка теломеразы
Теломеразная активность в клетках человека
Теломеразная активность в соматических клетках человека
Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека
Клетки волосяного сосочка
Мезенхимальные стромальныс клетки из процессированного липоаспирата
Окислительный стресс и гипоксия.
Активные формы кислорода.
Образование активных форм кислорода в митохондриях.
Антиоксидантная защита.
Образование при гипероксии и гипоксии
Старение клеток и кислород.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение и культивирование клеток.
Построение кривых роста
Введение гена каталитического компонента теломеразы в клетки человека
Радиоавтография
Введение гена в тсломеризованные фибробласты кожи.
Выявление активности галактозидазы в клетках.
Измерение теломеразной активности
Определение концентрации белка в клеточных экстрактах
Метод колониеобразования.
Колониеобразованис при разных парциальных давлениях кислорода.
Добавление антиоксидантов.
Добавление кондиционированной среды.
Колониеобразование на фидерных слоях
Индукция костной и жировой дифференцировок
Выявление остеодифференцировки
Выявление адииодифференцировки
Выявление активности щелочной фосфагазы.
Выделение и очистка мРНК
Обращая транскрипция
Индукция тубулогенеза кератиноцитов.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Получение и свойства теломеризованных клеток.
1. Имморталнзация фибробластов кожи, клеток волосяного сосочка и мезенхимальных стромальных клеток из процессироваиного липоаспирата
. . Имморталнзация фибробластов кожи
1.2. Иммортализация клеток волосяного сосочка.
1.3. Иммортализация мезенхимальных стромальных клеток из процессироваиного липоаспирата.
1.4. Измерение тепомеразной активности
2. Влияние парциального давления кислорода на пролиферацию теломеризованных клеток.
2.1. Влияние кислорода на фибробласты кожи ФКН и ФКННГЕЯТ
2.2. Влияние кислорода на клетки волосяного сосочка ОРИ и ОРИИТЕЯТ.
2.3. Влияние кислорода на МСК из процессироваиного липоаспирата и ИТЕЯТ
3. Влияние парциального давления кислорода на пролиферацию клеток, посеянных в низкой плотности.
3.1. Влияние кислорода на фибробласты кожи ФКН и ФКНИТЕЯТ
3.2. Влияние кислорода на клетки волосяного сосочка ЕРИ и ВРИИТЕЯТ.
3.3. Влияние кислорода на МСК из процессироваиного липоаспирата и ИТЕЯТ.
4. Способность к дифференцировке.
4.1. Дифференцировка фибробластов колси ФКН и ФКННТЕКГ.
4.2. Дифференцировка МСК из процессированного липоаспирата и ИТЕЯТ
4.3. Дифференцировка клеток волосяного сосочка ИРИ и йРМИТЕНТ.
4.4. Свойства йРП ИТЕЯТ
Особенности пролиферации теломеризованных клеток в низкой плотности.
1. Способность образовывать колонии клеток трех типов фибробластов кожи , иммортализованных с помощью введения ЬТЕ1ТГ фибробластов кожи Те1МС и эмбриональных фибробластов .
2. Влияние кондиционированной среды на распределение колоний по размерам
3. Влияние ближайшего окружения колоний на способность образовывать колонии.
4. Влияние парциального давления кислорода на способность образовывать колонии.
5. Влияние парциального давления кислорода на рост клеток Тс1МС в массовой культуре
6. Влияние ан гиоксидантов на способность образовывать колонии клеток ТеМС.
7. Влияние фидерного слоя на способность образовывать колонии
7.1. Получение теломеризованных фибробластов кожи, экспрессирующих 1галактозидазу.
7.2. Способность к образованию колоний клеток ТеШСра1.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Особенности пролиферации теломеризованных клеток в низкой плотности.
1 .Бимодальность распределения колоний теломеризованных клеток по размерам
2.Влиянис кондиционированной среды и микроокружения на распределение колоний по размерам.
3.Влияние кислорода на способность образовывать колонии.
4.Влияние антиоксидантов на способность образовывать колонии клеток Те1МС
5.Влияпие фидерного слоя на способность образовывать колонии
Получение и свойства теломеризованных клеток.
1.Иммортализация фибробластов кожи, клеток волосяного сосочка и мезенхимальных сгромальных клеток из процессированного липоаспирата.
2.Влияние кислорода на пролиферацию клепок, посеянных в низкой плотности
3.Способность к дифференцировке теломеризованных клеток
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


После того, как ген искусственно вырезали, клетки подсадили мышам, у которых был вызван диабет. Трансплантация клеток привела к тому, то уровень глюкозы в крови мышей сохранялся в норме в течение недель i, . Похожие эксперименты были проведены с генатоцитами человека и с клетками коры надпочечников , . Однако, далеко не все клетки удается иммортализовать с помощью введения гена . В ряде случаев требуется специальный подбор условий. Одна группа исследователей показала, что для иммортализации эпителиальных клеток кроме теломеразы необходимо также инактивация 6I4 i, . Другие исследователи обнаружили, что одного лить введения гена недостаточно, чтобы иммортализовать эндотелиальные клетки и фибробласты молочной железы ОНагс, . Еще одна группа исследователей сообщила, гго при введении гена каталитического компонента теломеразы в эмбриональные фибробласты человека, во всех полученных клонах экспрессировалась теломераза и поддерживалась длина тсломер, но способность к неограниченной пролиферации приобрели только 9 из клонов , . А эмбриональные фибробласты легкого человека удается иммортализовать только после снижения парциального давления кислорода с до , . То есть, во многих случаях требуется подбор специальных условий для того, чтобы клетки смогли приобрести способность к неограниченной пролиферации. И одним из факторов, влияющих на успешность иммортализации, может быть атмосферный кислород. Клетки культивируют при необычно высокой концентрации кислорода. Большинство клеток в организме подвергаются воздействию концентрации кислорода более близкой к 5, чем к атмосферного кислорода i, . Впервые влияние атмосферного кислорода на старение клеток в культуре была показано лет назад. Культивируя фибробласты I, на которых Хейфлик впервые показал, чао клетки могут поделиться конечное число раз, прежде чем прекратить пролиферацию, два исследователя и показали, что количество удвоений, которые может сделать клетка, не является фиксированной величиной , . Они показали, что на количество удвоений и продолжительность жизни клеток в культуре влияет концентрация кислорода в окружающем воздухе. Многие исследователи полагают, что существует прямая корреляция между концентрацией кислорода в окружающем воздухе и образованием активных форм кислорода внутри клегки ii, , , . Повышенное образование может приводить к повреждению ДНК, увеличению частоты мутаций и укорочению теломер, что з конечном счете приводит к преждевременной остановке пролиферации старению клеток под действием стресса. Поиск условий для получения иммортальных клеток, и изучение свойств полученных клеток может быть актуальной задачей не только клеточной терапии, но также иметь большое теоретическое значение. В работе, опубликованной еще в е годы, было показано, что обычные фибробласты человека гетерогенны по своему пролиферативному потенциалу. То есть, для массовой культуры существует предел Хейфлика, но отдельные клетки могут останавливаться гораздо раньше. Причем, чем ближе возраст кульгуры к пределу, тем больший процент отдельных клеток имеет маленький пролиферативный потенциал. В общем, распределение фибробластов по пролиферативному потенциалу бимодально. Всегда есть клетки, которые по какимто причинам перестают делиться и пролиферирующие клетки два пика распределения i i, . Опираясь на теломерную теорию старения, эту гетерогенность можно было бы объяснить, появлением клеток с очень короткими тсломерами, которые делали невозможной дальнейшую пролиферацию. То есть, можно было ожидать, что отдельные бессмертные теломеризованные клетки не будуг преждевременно прекращать пролиферацию. Это оказалось неверно. Неверным оказалось также и предположение о том, что клетки перестают делиться под действием окислительного стресса. Оказалось, что на пролиферацию клеток, посеянных в низкой плотности в значительной степени влияет наличие контактов с соседними клетками. Таким образом, именно изучение теломеризованных клеток заставляет подругому оценить гетерогенность пролиферативного потенциала исходных клеток.