Исследование структурных состояний ферментов рестрикции-модификации и их связи с каталитической активностью

• Автор: Овечкина, Лидия Григорьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 114 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФЕРМЕНТОВ РЕСТРИКЦИИМОДИФИКАЦИИ.

1.1. ПРИРОДА И ФУНКЦИИ ФЕРМЕНТОВ ЯМ СИСТЕМ

1.1.1. Обеспечение защитной функции

1.1.2. Участие в экспрессии генов

1.1.3. Функции репликации и репарации.

1.1.4. Регуляция различных клеточных процессов

1.2. СУЩЕСТВУЮЩИЕ ТИПЫ ЯМ СИСТЕМ.

1.2.1. ЯМ системы типа 1.

1.2.2. ЯМ системы типа II
1.2.3. ЯМ системы типа III.
1.3. МЕХАНИЗМ КАТАЛИЗА МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК
1.3.1. Классификация ДНК метилтрансфераз
1.3.2. ДНК С5цитозинметилтрансферазы.
1.3.3. ДНК аминометилтрансферазы.
1.4. СТЕХИОМЕТРИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЯМ СИСТЕМ ТИПА II СО СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ ДНК.
1.4.1. Взаимодействие эндонуклеаз рестрикции
1.4.2. Взаимодействие МТаз
1.4.3. Исследование ДНКферментных взаимодействий с использованием олигонуклеотидных дуплексов
1.4.4. Кинетические исследования МТаз.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1.Подготовка олигонуклеотидов.
4.2. Субстратсвязывающие свойства I МТазы при взаимодействии с членным олигонуклеотидным дуплексом
4.3. Сшивка субъединиц I МТазы глутаровым альдегидом
Глава 5. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУРНЫХ ФОРМ Т4 И I МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ
5.1. Характеристики предстационарной фазы реакции в условиях
насыщения МТазы фага Т4 субстратами
5.2. Кинетические параметры одного оборота метилирования субстраза Т4 МТазой
5.3. Стационарная кинетика метилирования синтетического олигонуклеотид ного дуплекса I МТазой
5.4. Кинетические параметры одного оборота реакции метилирования I метилазой
5.5. Характеристики предстационарной фазы реакции в условиях насыщения I МТазы субстратами
5.6. Различные комплексы Т4 Мазы и I МТазы с
субстратами и их возможная роль в реакции
Глава 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью данной работы явилось изучение структурных состояний ферментов рестрикциимодификации типа II при взаимодействии с синтетическими олигонуклеотидными субстратами, содержащими или не содержащими соответствующие специфические сайты узнавания. В качестве объектов исследования мы использовали высокоочищснные препараты таких ферментов, как эндонуклеаза рестрикции v, катализирующая гидролиз специфической последовательности , ДНКК6аденин метилтрансфераза фага Т4 Т4 МТаза, катализирующая метилирование экзоцикл ической 6аминогруппы аденина палиндромной последовательности , и ДНКЫ4цитозин метилтрансфераза из i iii I МТаза, которая катапизирует перенос мстильной группы в положение 4 первого остатка цитозина палиндромной последовательности . Изучение ферментсубстратных комплексов в растворах проводилось с использованием методологии исследования, основанной на применении взаимодополняющих подходов. Наряду с определением молекулярных масс ферментов и их комплексов с помощью гсльфильтрации и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы осуществлялась регистрация комплексов ДНК с белками методом задержки в геле, ковалентная сшивка олигомерных форм белка глутаровым альдегидом и кинетические исследования в стационарных и ирсдстационарных условиях. Все это позволило сопоставить структурные состояния исследуемых мстилтрансфераз с их каталитической активностью. На защиту выносится существование различных, обладающих функциональной активностью форм исследованных ферментов. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Системы рестрикциимодификации М были обнаружены в ii i более тридцати лет тому назад, благодаря своей роли ферментного барьера против вторжения фагов в геном клетки. М системы были обнаружены и выделены из многих видов бактерий, а их участки узнавания в последовательности ДНК идентифицированы 1, 2. Эндонуклеазы рестрикции катализируют гидролиз определенных участков ДНК 3, тогда как метилтрансферазы модифицируют ДНК клеткихозяина в тех же специфических участках, защищая тем самым ее от собственных эндонуклеаз рестрикции. Чужеродная ДНК узнается и разрезается рестриктазами по неметилированным участкам 4, 5. По эффективности защиты клетки от фагового заражения системы М значительно различаются так, снижение вероятности степени инфицирования колеблется от до 7 раз 6. Долгое время считалось, что разрушение чужой ДНК единственная функция рсстриктаз, но затем обнаружилось, что метилирование это не просто мечеиие своей или чужеродной ДНК, а некий важный процесс регуляции экспрессии генов во времени 7, 8, 9. Оказалось, что некоторые гены требуют неметилированного или полуметилированного состояния близлежащих сайтов для эффективной экспрессии . В последнее время обнаружено, что инфекция вирусом иммунодефицита человека приводит к росту клеточной ДНКметилтрансферазной активности и метилированию промоторной области гена уинтерферона, ведущему к понижению его экспрессии . По имеющимся данным не только метилазы имеют отношение к экспрессии генов, но и эндонуклеазы рестрикции. Обнаружено, что экспрессируемые гены более доступны для этих ферментов, чем нсэкспрессируемые , . Существуют ДНК метилазы бактерий, которые не имеют соответствующих рестриктаз. К ним относятся , и МТазы . Одной из функций МТазы, модифицирующей ДНК в положении 6 аденозинового основания сайта 53, является участие в пострепликативной репарации неправильно спаренных оснований ДНК . Метилирование служит для распознавания дочерней и родительской цепей. Репликативный комплекс включает в себя ДНК МТазу, благодаря чему в первые минуты после репликации профиль метилирования дочерней нити ДНК воссоздается по образцу материнской . Важной функцией как МТазы . МТаз является осуществление контроля над запуском процесса репликации в клеточном цикле бактерий , . Исследования ряда зарубежных групп направлены на установление связи между гипер и гипометилированием и репликацией опухолеродных вирусов и вируса иммунодефицита . Интересно, что в некоторых опухолевых клетках по сравнению с нормальными наблюдается гипометилирование ДНК .