Исследование функциональных групп и структуры глутаматдекарбоксилазы из E.coli

• Автор: Дарий, Екатерина Львовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил

1.1. Пиридоксалевыс ферменты

1.1.1. Основы теории пиридоксалевого катализа.

1.1.2. Классификации пиридоксалевых ферментов.

1.1.3. Особенности структуры пиридоксалевых ферментов

1.1.4. Функциональные группы пиридоксалевых ферментов

1.1.5. Структурнофункциональная роль пирилоксальфосфата.

1.1.6. Общие закономерности механизма действия пиридоксалевых ферментов

1.2. Декарбоксилазы аминокислот

1.2.1. Декарбоксилазы аминокислот из разных источников.

1.2.2. Глутаматдскарбоксилазы различною происхождения

1.3. Глутаматдекарбоксилаза из Е. i, структура и каталитические свойства

1.3.1. Функциональная роль бактериальных глутаматдекарбоксилаз.
1.3.2. Начальные исследования глутаматдскарбоксилазы из . i
1.3.3. Структура глутаматдскарбоксилазы из . i.
1.3.4. Функциональные труппы глутаматдекарбоксилазы
1.3.5. Взаимодействие апофермента с пиридоксальфосфатом и его аналогами
1.3.6. Каталитические свойства глутаматдекарбоксилазы
1.3.6.1. Исследования субстратной специфичности глутаматдекарбоксилазы.
1.3.6.2. Реакция побочного трансаминнрования.
1.3.6.3. Последовательность стадий ферментативного дскарбоксилирования.
1.4. Заключение по литературному обзору и обоснование исследования.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Штаммы
2.1.2. Среды для выращивания.
2.1.3. Реактивы
2.2. Мегоды
2.2.1. Получение бактериального материала
2.2.1.1. Выращивание бактериального материала из природного штамма.
2.2.1.2. Трансформация клеток плазмидной ДНК.
2.2.1.3. Выращивание бактериального материала из рекомбинантных штаммов
2.2.2. Очистка глутаматдекарбоксилазы из штамма . i 0 .
2.2.3. Очистка глутаматдекарбоксилазы из штаммов . i 3 и
. i 3.
2.2.4. Получение апофермента и его реактивация.
2.2.5. Определение ферментативной активности.
2.2.6. Определение концентрации белка и степени гомогенности препаратов
2.2.7. Определение Кт
2.2.8. Оптические методы исследования
2.2.9. Электронная микроскопия.
2.2 Модификация белка бутандионом
2.2 Определение содержания остатков аргинина, триптофана и цистеина
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Получение рекомбинантного фермента
3.2. Функционально важный остаток аргинина каталитически активной формы глутаматдекарбоксилазы
3.3. Исследование процесса реактивации и восстановления четвертичной структуры глутаматдскарбоксилазы при взаимодействии димеров апофермента с пиридоксальфосфатом.
3.3.1. Определение остатков цистеина в различных формах глутаматдскарбоксилазы
3.3.2. Восстановление оптических свойств фермента при добавлении пиридоксальфосфата к димерной форме аподекарбоксилазы
3.3.3. Реактивация фермента
3.3.4. Восстановление четвертичной структуры фермента
3.3.5. Экранирование остатков цистеина.
3.4. Влияние и пиридоксальфосфата на вторичную и четвертичную структуру рекомбинантной глутаматдскарбоксилазы.
3.4.1. Электронномикроскопические исследования
3.4.2. Изучение вторичной структуры различных форм глугаматдекарбоксилазы методом кругового дихроизма
3.4.3.Анализ структурных изменений при взаимном превращении различных форм глутаматдскарбоксилазы.
3.5. Получение 7аминомасляной кислоты путем биотрансформации Ьглутаминовой кислоты.
ЛИТЕРАТУРА
Список сокращений
ПЛФ пиридоксальфосфат
ПМФ пиридоксаминфосфат
Г1ЭГ полиэтиленгликоль
ПААТ полиакриламидный гель
ДТНБ 5,5дитиобис2нитробензойная кислота
ПХМБ яхлормеркуриобензоат
4,4ДТД 4,4ДИТКОДИПиридин
ДОФА диоксифенил аланин
КД круговой дихроизм
ДГГ дитиотреитол
ЭДТА этиле ндиаминтетраацетат
i i x
додецилсульфат натрия
ВВЕДЕНИЕ


Очистка глутаматдекарбоксилазы из штамма . Очистка глутаматдекарбоксилазы из штаммов . Получение апофермента и его реактивация. Определение ферментативной активности. Электронная микроскопия. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Исследование процесса реактивации и восстановления четвертичной структуры глутаматдскарбоксилазы при взаимодействии димеров апофермента с пиридоксальфосфатом. Экранирование остатков цистеина. Влияние и пиридоксальфосфата на вторичную и четвертичную структуру рекомбинантной глутаматдскарбоксилазы. Анализ структурных изменений при взаимном превращении различных форм глутаматдскарбоксилазы. Получение 7аминомасляной кислоты путем биотрансформации Ьглутаминовой кислоты. Исследования пиридоксалевых ферментов, в основе которых лежат работы акад. А.Е. Браунштейна, являются важным направлением современной энзимологии. Пиридоксалевые ферменты катализируют разнообразные превращения аминокислот в организме и играют, таким образом, существенную роль в фундаментальных физиологических процессах. Современные достижения в понимании структуры и механизма действия этих ферментов, их роли и функции широко используются в различных областях медицины и биотехнологии. В последнее время достигнуты значительные успехи в установлении детального механизма действия различных пиридоксалевых ферментов Быстро растет число ферментов, для которых определена трехмерная структура, однако механизм формирования пространственной структуры подробно охарактеризован лишь в некоторых случаях. Исследование процессов образования биологически активной макромолекулы у ПЛФферментов, принадлежащих к одному и тому же или к разным семействам, может дать важную информацию о том, каким образом первичная структура и взаимодействие белка с коферментом определяют пространственную структуру и функцию фермента. Среди многих пиридоксалевых ферментов важное физиологическое значение имеют декарбоксилазы аминокислот, катализирующие образование биогенных аминов. Большинство бактериальных декарбоксилаз обладают сложной олигомерной структурой и поэтому могут служить хорошей моделью для изучения закономерностей формирования стабильной четвертичной структуры при ассоциации субъединиц. Настоящая работа посвящена исследованию свойств глутаматдекарбоксилазы из Е. Фермент является удобным объектом для анализа структурных изменений, происходящих при связывании кофермента с апоферментом и образовании нативной макромолекулы, способной осуществлять каталитическую реакцию. Цель и задачи исследования Цель данной работы состояла в изучении функционально важных остатков аминокислот глутаматдекарбоксилазы из Е. И, а также в исследовании процесса сборки биологически активного гексамера из димеров апофермента и установлении влияния и пиридоксальфосфата на организацию структуры фермента. Задачи работы были следующие исследование роли остатков аргинина и цистеина глутаматдекарбоксилазы характеристика процесса реактивации и реконструкции гексамера глутаматдекарбоксилазы при взамодействии димеров апофермента с пиридоксальфосфатом сравнительный анализ элементов вторичной структуры холофермента и апофермента установление роли ПЛФ и в организации вторичной и четвертичной структуры фермента. Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана методика выращивания биомассы из штаммовсуперпродуцентов и выделения из нее гомогенного рекомбинантного изозима САБа, препараты которого оказались пригодными для кристаллизации. Установлено, что в активный центр глутаматдекарбоксилазы входит остаток аргинина, который участвует в связывании субстрата. Получены данные об изменении доступности остатков цистеина при восстановлении нативного гексамера из димеров апофермента. Проведена сравнительная оценка вторичной структуры различных форм холофермента и апофермента САОа, выявлен вклад кофермента и в организацию структуры. Подобраны условия для осуществления количественного декарбоксилирования глутаминовой кислоты с образованием уаминомасляной кислоты. Получен патент РФ 2 Способ получения уаминомасляной кислоты от декабря г.