Сравнение механизмов протекторного действия L-глутаминовой кислоты и гексапептида TGENHR на TNF-индуцированную гибель клеток линии HL-60

• Автор: Гибанова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ ФАКТОРА НЕКРОЗА

ОПУХОЛИ И ЕГО ОБЩИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

1.1. Общие биологические свойства фактора некроза опухоли

1.2. Активация транскрипционного фактора кВ

1.3. Образование вспомогательного комплекса при проведении сигнала

рецептором

1.4. Липидные микродомсиы клеточной мембраны как функциональные

модуляторы сигнальных путей семейства рецепторов .

1.5. Участие различных протеаз в сигнальных каскадах, индуцируемых .

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Исследование дифференцирующей активности гексапептида ,

глутаминовой кислоты и на клетках линии II.
2.2. Гексапептид и глутаминовая кислота повышают
опосредуемую активацию фосфолипазы С.
2.3. Гексапситид и I усиливают опосредованную экспрессию
эндогенного фактора некроза опухоли
2.4. Влияние пептида , глутаминовой кислоты и на цикл
клеточного деления.
2.5. Исследование влияние гексапептида и глутаминовой кислоты на
индуцированную гибель клеток.
2.6. Исследование влияния и на иидуцируемую активацию
транскрипционного фактора кВ
2.7. Влияние и па опосредуемую активацию каспазы3 и
каспазы 8.
2.8. Гексапептид отменяет церамидиндуцироваиный апоптоз
2.9. Заключение.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Материалы
3.2. Буферные растворы
3.3. Методы.
3.3.1. Культивирование клеток
3.3.2. Определение дифференцирующей активности.
3.3.3. Определение внутриклеточной концентрации ипозитолмоио и днфосфатов в клетках линии .
3.3.4. Приготовление агарозного геля
3.3.5. Выделение суммарной РНК
3.3.6. Получение кДНК из клеток.
3.3.7. Полуколичественная конкурентная ПЦР
3.3.8. Обратной транскрипции ПЦР .
3.3.9. Гельэлектрофорез
3.3 Выделение продуктов ПЦР из геля.
3.3 Определение уровня клеточной гибели.
3.3 Определение апоптоза в клетках цитофлуориметрическим методом
3.3 Определение активности клеточных каспаз 8,
3.3 электрофорез белков в полиакриламидном геле.
3.3 Иммуиоблотаиализ.
3.3 Анализ цикла клеточного деления.
3.3 Анализ экспрессии маркеров дифференцировки и
4. ВЫВОДЫ.
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


В подавляющем большинстве клеток Т1и является ключевым медиатором в передаче сигналов, опосредованных ТОРос ТЫРЯ2, по всей вероятности, выполняет важную роль в функционировании лимфоидной системы. На молекулярном уровне выделяют три основных эффекта, определяющие пути реализации разнообразных клеточных ответов, обусловленных взаимодействием ТКРа с ТОТИз а активация транскрипционного фактора ЫРкВ б активация стрессактивируемых протеинкиназ ЗАККвЛЫК в индукция апоптоза. При действии Та инициация процесса апоптоза осуществляется двумя путями прямым рецепторным и митохондриальным 5. Терапевтическое применение ТЫРа в качестве противоопухолевого агента осложнено изза его общей высокой токсичности, связанной с широким спектром биологических активностей этого цитокина. Поэтому одним из подходов к использованию этого цитокина для лечения злокачественных новообразований является поиск агентов, которые снижали бы его токсическое действие, но позволяли бы сохранить его противоопухолевую активность. В последние годы активно разрабатываются терапевтические методы на основе комбинаторного применения этого цитокина с различными индукторами дифференцировки либо химического полностьютрансреттоъъая кислота, димстилсульфоксид, форболовыс эфиры, либо биологического происхождения ростовые факторы СМСБР и 0С8Р, интерферон, что способствует усилению дифференцирующего эффекта на опухолевые клетки при снижении токсического действия ЮТа на организм. Такими соединениями могут оказаться гексапептид ТСБМЩ и глутаминовая кислота, являющиеся индукторами гранулоцитариой дифференцировки клеток миелоидного ряда. Гсксапсптид 6 является фрагментом эндогенного фактора дифференцировки клеток линий промислоцитарного лейкоза человека i iii , который полностью воспроизводит дифференцирующую активность полноразмерного фактора. Установлено, что в основе механизма действия 6 на клетки , не имеющего собственного рецептора на поверхности клеток, лежит его способность взаимодействовать с липидным компонентом клеточных мембран 6. В ходе исследований было установлено, что наряду с дифференцирующей активностью, гексапептид обладает ярко выраженными протекторными свойствами. Пуркинье червя мозжечка крыс i viv и гранулярные нейроны мозжечка крыс i vi при индуцируемой химической гипоксии 7. Кроме того, гексапептид повышает устойчивость клеток и мышиных эмбрионов к холодовому шоку и ионизирующей радиации 8. Было также продемонстрировано нейропротекториое действие этого пептида на моделях болезни Альцгеймера i viv и i vi 9. Была продемонстрирована важная роль глутаминовон кислоты в составе этого пептида, замена, которой приводила к исчезновению биологической активности I6 6. Кроме того, было обнаружено, что свободная , как и пептид, проявляет антипролиферативиос и дифференцирующее действие па клетки , при отсутствии специфического рецептора на мембране клеток этой линии Существуют данные, что многие из этих процессов дегенерации клеток потенцируются фактором некроза опухоли . Данная работа является частью структурнофункциональных исследований проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по изучению биологически активного шестичленного фрагмента эндогенного фактора дифференцировки клеток линий промиелоцитарного лейкоза человека 6. Целыо работы являлось сравнительное изучение влияния гексапептида II 6 и . II промиелоцитарного лейкоза человека. В рамках этой работы были поставлены следующие задачи 1 выяснение характерных особенностей дифференцирующего действия гсксапсптида II6, , и 2 исследование влияния гсксапсптида 6 и I на клеточную гибель, вызываемую действием 3 изучение молекулярного механизма действия 6 и II на опосредованную клеточной гибель. Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, кандидату химических наук И. В.М. Липкину за постоянное внимание к данной работе и помощь в ее проведении. Автор также признателен кандидату химических наук С. В. Хайдукову ИБХ РАН за помощь в проведении цитофлуориметрического анализа и кандидат химических наук Л. Н. Шингаровой за предоставленный фактор некроза опухоли .