Нуклеотид-зависимая деградация нуклеиновых кислот ДНК- и РНК-полимеразами

• Автор: Сосунов, Василий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

1. Ферменты
3. Нуклеозид5 трифосфаты, динуклеозидгетрафосфаты, олигонуклеотиды, умбеллиферонтрифосфат

4. Составы буферов реакционных смесей

5. Условия реакций, катализируемых ДНКполимеразами. Анализ продуктов реакций

6. Условия реакции синтеза РНК, катализируемой Т7 РНКполимеразой

7. Условия реакций, катализируемых РНКполимсразой . i. Анализ продуктов реакций

8. Реакции, катализируемые щелочной фосфатазой и фосфодиэстеразой змеиного яда

9. Метод железного расщепления

. Определение , , Vx

. Компьютерное моделирование Результаты и обсуждение

Раздел 1. Нуклеотидзависимое вьпцепление Зконцевого остатка праймера ДНКполимеразами псевдопирофосфоролиз. Продукты реакции псевдопирофосфоролиза динуклсозид5,5тетра и трифосфаты являются субстратами для различных ДНКполимсраз в реакции полимеризации. Динуклеозид5,5тстрафосфаты также являются субстратами для некоторых РНКполимераз
1.1. Реакция псевдопирофосфоролиза
1.2. Продукты реакции псевдопирофосфоролиза динуклеозидтетра и трифосфаты являются субстратами различных ДНКполимераз в реакции полимеризации
1.3. Рибодинуклеозид5,5тетрафосфаты являются субстратами для РНКполимераз
Раздел 2. Нуклеотидзависимое вьпцепление Зконцевого остатка РНК РНКполимеразами экзонуклеазное вьпцепление. Единый механизм реакций полимеризации и деградации, катализируемых одним активным центром
2.1. Стимуляция экзонуклеазной активности РНКП Е i некомплементарными нуклеозидтрифосфатами
2.2. Некомплсментарные нукпеозидтрифосфаты приносят и ориентируют в активном центре ион 2, катализирующий экзонуклеазное выщепление
2.3. Влияние мутаций в РНКП . i на экзонуклеазную активность
2.4. Пирофосфат может вызывать либо пирофосфоролиз, либо экзонуклеазный гидролиз
2.5. Стимуляция экзонуклеазной активности щелочными
2.6. Моделирование активного центра РНКП . i


2.7. Сайт связывания некомплементарного нуклеозид5трифосфата
2.8. Замена каталитических аспартатов в активном центре РНКП блокирует полимеризациюпирофосфоролиз и нуклсазный гидролиз, катализируемый РНКП
Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДНКП ДНКполимераза
ПААГ полиакриламидный гель
РНКП РНКполимераза
ТСХ тонкослойная хроматография
ТЭК остановленный тройной элонгационный комплекс
V обратная транскриптаза вируса миелобластаза птиц
азидотимидин дидсзокси3азидотимидин
азидотимидин5трифосфат
Зциклогексиламин1пропан сульфокислота СбНцКНСН2ззН стабильный закрытый элонгационный комплекс, неспособный к элонгации x
V обратная транскриптаза вируса гепатита В уток , дезоксирибо и рибо5 трифосфат , дезоксирибо и рибо5дифосфат , дезоксирибо и рибо5монофосфат сЦТ 2,3дидезокси2,3дидегидротимидин x динуклеозидолигофосфат диметнлформамид дитиотреитол
этилендиаминтетрауксусная кислота
, В прокариотические транскрипционные факторы, стимулирующие эндонуклеазную активность клеточной РНКП IV вирус иммунодефицита человека
IV обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека V обратная транскриптаза вируса мышиного лейкоза Молони I 1,4пиперазинбисэтансульфокислота
фенилметилсульфонилфторид додецилсульфат ТВА трибутиламкн
1I эукариотические транскрипционный фактор, стимулирующий эндонуклеазную активность клеточной РНКП i 2амино2гидроксиметил1,3пропандиол
ВВЕДЕНИЕ


Нуклеотидзависимое вьпцепление Зконцевого остатка праймера ДНКполимеразами псевдопирофосфоролиз. Продукты реакции псевдопирофосфоролиза динуклсозид5,5тетра и трифосфаты являются субстратами для различных ДНКполимсраз в реакции полимеризации. Раздел 2. Нуклеотидзависимое вьпцепление Зконцевого остатка РНК РНКполимеразами экзонуклеазное вьпцепление. Влияние мутаций в РНКП . Моделирование активного центра РНКП . Многие ДНКполимеразы ДНКП помимо функции синтеза ДНК обладают радом дополиительньрс активностей. Все ДНКП способны осуществлять пирофосфоролиз реакцию обратную полимеризации. Кроме того, у многих полимераз имеется отдельный экзонуклеазньтй активный центр, осуществляющий экзонуклеазную реакцию. Подобная активность описана для прокариотических ДНКП I типа i, и эукариотических ДНКП 5, , и полимераза а обладает такой активностью лишь у некоторых видов Михайлов, . ДНКП I прокариот обладают также дополнительной экзонуклсазной активностью, осуществляемой отдельным активным центром. Клеточные РНКполимеразы РНКП также способны катализировать реакцию пирофосфоролиза. Кроме этого, они обладают эндонуклеазной активностью, которая существенно стимулируется в присутствии белковых факторов СЗтеА и у прокариот v . I1 у эукариот i, , . Предполагается, что эндонуклеазнос расщепление РНК осуществляется в том же активном центре, что и реакции полимеризации и пирофосфоролиза. Для эукариотической РНКП II описана также экзонуклеазная активность, которая, как и эндонуклсазная стимулируется белковым фактором II , . Было показано, что факторстимулируемая экзонуклеазная активность РНКП II играет важную роль в процессе коррекций синтеза РНК i vi . Недавно была обнаружена новая реакция, катализируемая различными ДНКполимеразами. Реакция заключается в выщеплении Зконцевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных либо например, величина К в этой реакции для гАТР 1. М, с образованием, соответственно, динуклеозид5,5тетра и трифосфатов . IV IV . Показано . IV , содержащие замены, обусловливающие устойчивость вируса к i viv, существенно эффективней, чем фермент дикого типа, выщепляют 3концевой терминирующий остаток ДНКпраймера в присутствии высокой концентрации АТР и смеси четырех природных нуклеозидтрифосфатов при этом происходит разблокирование праймера и продолжение синтеза ДНК. Кроме этого, роль реакции псевдопирофосфоролиза может заключаться в коррекции синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих корректирующей экзонуклеазной активностью например, обратные транскриптазы ретровирусов, в том числе и IV , эукариотические ДНКП а, и другие. Для РНКП реакция псевдопирофосфоролиза не известна. Поиск подобной реакции для РНКП интересен, особенно с точки зрения возможного ее участия в процессе коррекции синтеза РНК. Поиск и выяснение механизма нуклеотидзависимой деградации РНК у мультисубъединичной клеточной РНКП . Другой целью данной работы было выяснение, являются ли субстратами для ДНК и РНКполимераз продукты реакции псевдопирофосфоролиза динуклеозидтри и тетрафосфаты. Жизненно важным для всех биологических организмов является наличие и поддержание оптимального баланса скорости и точности репликации и транскрипции. В процессе репликации ДНК в клетках . Хромосома . Уровень точности полимеризации самой по себе недостаточен для объяснения уровня точности, наблюдаемого в клетках. Так показано, что в экспериментах i vi ДНКП включают в цепь ДК один неправильный остаток на каждые правильных. ДНКП I . Одной из наиболее вероятных причин ошибок является то, что азотистые основания могут находиться в нескольких таутомерных конформациях, что позволяет образовывать прочные водородные связи между неправильными нуклеотидами рис. Сох, . Рис. I. Таутомерные формы азотистых оснований нуклеотидов на примере урацила. Основная форма при 7 лактам, формы Ь. Таким образом, точность синтеза i viv поддерживается за счет дополнительных энзиматических механизмов. Первым из таких механизмов, присущим теоретически всем ДНКП см.