Регуляторные участки ДНК в минихромосомах инфузории Stylonychia lemnae, несущих гены α1- и α2-тубулина

• Автор: Райхель, Ирина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 138 с. : ил.

1.1 Организация пнома макронуклнуса у крюхоресничных инфузории

1.2. РЕ1ТЛЯТОРНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК. КОНТРОЛИРУЮЩИЕ РЕПЛИКАЦИЮ У ЭУКАРИОТ

1.3. Регуляторныглюслеловательности ДНК. КОНТРОЛИРУЮЩИЕ РЕПЛИКАЦИЮ У ИНФУЗОРИЙ

1.4. Регуляторные последовательности ДНК, контролирующие

ТРАНСКРИПЦИЮ У ЭУКАРИОТ.

1.4.1. Понятие о корпролютере.

1.4.2. ТЛТАбокс.

1.4.3. Инициатор.

1.4.4. Правый промотор 1ыи элемент

1.4.5. Другие элементы корпромотора.

1.5. Регуляторные участки, контролирующие транскрипцию

МАКРОНУКЛЕАРИЫХ ГЕНОП, КОЛИРУЮЩИХ Г,ЕЛКИ БРЮХОРЕСНИЧНЫХ ИНФУЗОРИЙ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2. 1. 1. Клоны и условия культивирования брюхопсспичиых инфузорий.
2.1.2. Штаммы бактерий и условия их культивирования.
2.1.3. ЛИК олигонуклеотиды
2.1.4. Векторы и ДНКкоиструкиии
2.2. Методы
2.2. . Трансфекция 1ептае и получение клональных клеточных линий.
2.2.2. Молекулярнобиологические методы.
2.2.3. Приготовление смеси искусственных лтнихромосом и котрансфскция клеток 1етпае.
2.2.4. Анализ ДНК методом пропорциональной ПЦР
2.2.5. Анализ ПИК методом блотгибридизаиии по Саузериу.
2.2.6. Анализ РНК методом обратной транскрипции.
2.2.7. Сиквеис ЛИК и определение точек начала транскрипции
2.2.8. Индукция экспрессии генов тубулина обработкой клеток 1стпас лек типом Коп А
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Разработка метола котрансфекнии инфузории Ятушсша ееишав .
3.1.1. Разработка метода котрансфекнии инфузории Б. 1стпае применительно к изучению рстикаиии ЛИКмииихпомосом
3.1.2. Разработка метода котрансфекнии инфузории Я. Iстпае применительно к анализу регуляции транскрипции
3.2. ПОИСК РЕГУЛЯТОРНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ. КОНТРОЛИРУЮЩИХ РЕПЛИКАЦИЮ В МИНИХРОМОСОМЕ. КОЛИРУЮЩИЙ ГЕН а ТУБУЛИНА
3.2. I. Замена 5 и Знекодирующих участков гена тубулина не влияет на
репликацию ЛИК
3.2.2. Удаление 5 и Знекодирующих участков гена атубулина не влияет на репликацию ДНК
3.2.3. Замена участка, кодирующего а1тубулин, не влияет па рспикацшо ДНК
3.2.4. Линейные векторы, лишенные теломеров. не поддерживаются в макронуклеусах трансфсцированных инфузорий 1етпас
3.3. Поиск РГ.ГУЛЯТОРШЛХ последовательность, контролирующих
ТРАНСКРИПЦИЮ В МИНИХЮМОСОМЕ. НЕСУЩЕЙ ГЕН а1ТУГ,УЛИПА.
3.3. 1. Лелеииопный анализ 5 некодирующего участка гена аIтубулина.
3.3.2. Анализ 5 некодирующего участка гена атубулина с помощью несущих замены конструкций.
3.3.3. Определение элементов промотора в генах 5. 1стпае, кодирующих тубулины. путем сравнения последовательностей1.
3.3.4. Поиск регуляторных последовательностей. контролирующих индукцию транскрипции в минихромосоме, кодирующей ген а2тубулина.
ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Адекватность метола котрансфекнии поставленным задачам
3.2. Особенности репликации минихромосом в мдкронуклеусе инфузории ,5. 1.еше.
3.2.1. Рстикаиия минихромосом, несущих ген атубулина. не зависит от какихлибо последоаатсльностеи ЛИК, расположенных в некодирующих участках и в кодирующем участке минихромосомы
3.2.2. Теломеры как сайты инициации репчикации в минихромосомах инфузорий.
3.2.4. Проблема поддержания постоянства числа копий минихромосом в макрон уклсусах инфузорий.
3.3. Элементы корпромотора в генах кодирующих туьулины у ьещае
3.4. Эффективность транскрипции генов а1 и а2тубулина
3.5. Индукция транскрипции гена а2тубулина контролируется
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ НГО ПРОМОТОРА
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПАА полиакриламид
п.н. пара нуклеотидов
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
ТР белок, связывающийся с теломером
ППЭ правый промоторный элемент
ПСА персульфат аммония
ПЦР полимеразная цепная реакция
ТЕМЭД , , , Мтетраметилэтилендиамин
этилендиаминотетраацетат
додецилсульфат натрия
стандартный солевой буфер с цитратом
ВВЕДЕНИЕ


Вообще у эукариот последовательности, определяющие репликацию, и сайты инициации репликации изучены до настоящего времени мало. Наиболее детально они определены у vii см. Изучение регуляторных последовательностей, контролирующих репликацию у инфузории . Типичный эукариотный базовый промотор, инициирующий транскрипцию с помощью РНК полимеразы II, содержит ТАТАбокс, расположенный на п. Инициатор, окружающий эту точку , , . Такие элементы эукариотного промотора, как СААТбокс, энхансср и индуктор, модулируют транскрипцию. До настоящего времени основные функциональные элементы промотора были описаны лишь у небольшого количества генов брюхоресничных инфузорий. Это связано с тем, что в своем анализе исследователи чаще всего используют сравнение последовательностей и ищут последовательности, которые характерны для высших эукариот , i, i, i . Экспериментально промоторы инфузорий изучены мало. В ряде работ высказаны предположения о том, что промотор брюхоресничных инфузорий не содержит элементов типичного эукариотного промотора . Экспериментальное определение элементов промотора у брюхоресничной инфузории . Целью настоящей работы был поиск и анализ регуляторных участков ДНК в минихромосомах макронуклеуса у инфузории . На основе макронуклеарных хромосом . Зиекодирующих областях и теломерах, предположительно участвующих в регуляции транскрипции и репликации. Разработать метод котрансфекции инфузории . ДНКпоследовательности в изучаемых областях минихромосомы. Получить соответствующие трансфецировапныс клоны инфузории. Сравнить эффективность репликации i viv искусственных минихромосом, несущих ген тубулина и содержащих нативные и мутантные участки ДНК. Определить ДНКпоследовательности, выполняющие функции сайга инициации репликации в минихромосомах . Определить роль тсломеров в репликации мпиихромосом в макронуклеусе . Сравнить эффективность транскрипции i viv векторов, несущих нативные и мутантные участки ДНК в нетранскрибируемой области 5участка минихромосомы тубулина. Выявить участки, необходимые для корректной инициации транскрипции этого гена. На основе сравнения с последовательностями ДНК других минихромосом брюхоресничных инфузорий выявить консенсусные последовательности различных элементов промотора гена тубулина. Проанализировать i viv транскрипцию мутантных версий минихромосомы а2тубулина в нормальных условиях и при индукции синтеза тубулина
под воздействием лектина Конканавалина А. Определить локализацию индуктора транскрипции в этом гене. Генетическая трансформация, выбранная нами в качестве основного метода исследования, является наиболее распространенным методом изучения функции генома у различных организмов. В наших экспериментах этот метод позволял оценивать влияние тех или иных изменений исследуемых участков ДНК на процессы транскрипции и репликации. С его помощью мы определяли регуляторные области, ответственные за контроль над этими процессами. Существуют несколько вариантов метода генетической трансформации, а также способов введения чужеродного генетического материала в геном исследуемой клетки. Для экспериментов, представленных в настоящей работе, наиболее подходящим был метод стабильной трансфекции макронуклеуса инфузории линейными векторами, разработанный ранее Бкоуогобкш е а. Трансформированные таким образом стилонихии поддерживают интродуцированные последовательности ДНК в неизменном виде в большом количестве копий до нескольких миллионов на один геном макронуклеуса в течение длительного времени, ограниченного только продолжительностью жизни данной клеточной линии клоны 1стпае жизнеспособны в течение нескольких лет. Для успешной и эффективной трансформации вегетативных особей инфузорий требуется введение в макронуклеус большого количества копий вектора. Единственным методом, позволяющим добиться необходимых результатов, является микроинъекция. Макронуклеус этой инфузории имеет достаточно большие размеры порядка 0 мкм в длину и гантелеобразную форму, причем каждая из двух его половин по форме близка к сферической. Это дает возможность при микроинъекции вводить раствор ДНК в обе половины макроиуклсуса.