Кристаллизация и исследование структуры фактора терминации трансляции RF1 и фактора рециклинга рибосом RRF из Thermus thermophilus

• Автор: Тин, Ульяна Феликсовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 80 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ФАКТОРЫ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ И РЕЦИКЛИНГА РИБОСОМ

Глава 1. Белковые факторы терминации

1. Фактора теминации первого и второго класса у прокариот и эукариот.

2. Исследования структуры факторов терминации I класса .

2.1. Сайт узнавания стопкодона

2.2. Сайт связывания факторов I класса с фактором II класса

2.3. Гидролиз пептидилтРНК

3. Связывание факторов терминации на рибосоме

4. Структура эукариотического фактора терминации еИР 1.
Глава 2. Фактор рециклинга рибосом ЮП7.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Материалы и методы.
1. Материалы.
2. Приборы.
3. Методы
3.1. Выделение фактора терминации ПЯР1.
3.2. Протеолиз фактора терминации ПЯР1.
3.3. Анализ продуктов протеолитического гидролиза ПЯРТ.
3.3.1. Определение Ыконцевой последовательности фрагментов ЦР
3.3.2. Определение точного молекулярного веса фрагментов ИРГ
3.4. Выделение фрагментов ЦИЛ1, ШР1, ПЯРТ2
3.5. Выделение фактора рециклинга рибосом ПШР.
3.6. Гельэлектрофорез белков в полиакриламидном геле с БЭБ
3.7. Кристаллизация белков.
3.7.1. Выращивание крупных кристаллов ПЕР2
3.7.2. Выращивание крупных кристаллов ЦЮ1Р и получение тяжелоатомных производных этих кристаллов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Выделение и исследование фактора терминации
ИР из ТЬегтш ШегторЬНт.
1. Выделение фактора терминации КН ТлИегторИНиБ
2. Кристаллизация интактного фактора терминации ..
3.1 Гротеолиз фактора терминации ЦЮ7.
3.2. Выделение фрагментов фактора терминации КБ.
3.3. Кристаллизация фрагментов фактора терминации ЦЯБ1.
Глава 2. Выделение, кристаллизация и исследование структуры
фактора рециклинга рибосом ИЯТ ТИсгтт ИегторИш.
1. Выделение фактора ЯКЕ ТлИегторМт
2. Кристаллизация фактора ЦИЛТ.
3. Исследование структуры фактора ЛИР.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Глава 1. Фактора теминации первого и второго класса у прокариот и эукариот. Исследования структуры факторов терминации I класса . Структура эукариотического фактора терминации еИР 1. Глава 2. Фактор рециклинга рибосом ЮП7. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Материалы и методы. Материалы. Приборы. Выделение фактора терминации ПЯР1. Протеолиз фактора терминации ПЯР1. Анализ продуктов протеолитического гидролиза ПЯРТ. Выделение фактора рециклинга рибосом ПШР. Кристаллизация белков. Выращивание крупных кристаллов ЦЮ1Р и получение тяжелоатомных производных этих кристаллов. Глава 1. ИР из ТЬегтш ШегторЬНт. Кристаллизация интактного фактора терминации . . Гротеолиз фактора терминации ЦЮ7. Выделение фрагментов фактора терминации КБ. Кристаллизация фрагментов фактора терминации ЦЯБ1. Глава 2. ИЯТ ТИсгтт ИегторИш. Кристаллизация фактора ЦИЛТ. Исследование структуры фактора ЛИР. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ. Изучение механизма биосинтеза белка является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Для детального понимания механизма работы бслоксинтезирующего аппарата клетки необходимо знание структурной организации его компонентов. Единственный метод, позволяющий определить структуру крупных биополимеров с атомарным разрешением, это метод рентгеноструктурного анализа. В настоящее время наиболее перспективными для рентгенографических исследований являются белки и нуклеиновые кислоты из термофильных микроорганизмов, т. Однако даже такие стабильные белки не всегда удается закристаллизовать. Для проведения экспериментов по кристаллизации необходимы препаративные количества гомогенного нативного белка высокой степени чистоты. Структурные и динам ическкие свойства молекул белка также в значительной степени влияют на их склонность к кристаллизации. В Институте белка РАН работа по выделению, кристаллизации и структурным исследованиям компонентов аппарата трансляции из грамотри цателыюй экстремально термофильной эубактерии ТИеппт ЖегторЬИш ведется уже более лет. В сотрудничестве с рядом кристаллографических групп были определены пространственные структуры ряда рибосомных белков и их комплексов с РНК. Также была решена пространственная структура одного из важнейших компонентов белоксинтезирующей системы, фактора элонгации ЕРв из ТИеппт ЖегторИИиБ. Данная диссертация посвящена разработке методов выделения, кристаллизации и исследованию структуры фактора терминации ИЛ и фактора рециклинга рибосом ЯЯР из Т. МегторИИт. В процессе работы нами была разработана методика выделения препаративных количеств фактора терминации ИРГ Г. Ь i. Проведен поиск условий кристаллизации интактного фактора. Получены и проанализированы крупные протеолитические фрагменты фактора 1 и показано, что концевая область молекулы более стабильна к гидролизу, в отличие от Сконцевой области. Наработаны препаративные количества каждого из фрагментов и проведены эксперименты по кристаллизации. Были получены кристаллы наиболее крупного фрагмента и проведены предварительные кристаллографические исследования. Так же в ходе работы была разработана методика выделения препаративных количеств фактора рециклинга рибосом Т. .i. Проведен поиск условий кристаллизации фактора и получены кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа и отражающие рентгеновские лучи с разрешением 2. . Кристаллы были использованы для определения структуры фактора. Анализ структуры совместно с экспериментами по мутагенезу показал наличие функционально важной внутримолекулярной подвижности фактора, влияющей на уровень его акгивности.