Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

• Автор: Сычева, Елена Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Скрытый метаболизм

1.1.1. Примеры реакций скрытого метаболизма

1.1.2. Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина.

1.1.3. Механизм токсического действия иорлейцина.

1.1.4. Получение аналогов белков, содержащих неканонические аминокислоты

1.2. Пути метаболизма треонина в клетках . i.
1.2.1. Биосинтетическая треониндезаминаза
1.2.1. Аэробные пути дщрадации треонина
1.2.2. Анаэробный путь деградации треонина.
1.2.3. Регуляция транскрипции оперона.
1.2.4. ТРРзависимый путь деградации треонина
1.2.5. Метилцитратиый цикл метаболизма пропионилКоА.
1.3. Синтазы ацетогидроксикислог в синтезе разветвленных аминокислот у . i.
1.3.1. Классификация синтз ацетогидроксикислог и их метабол ическая роль
1.3.2. Изоферменты у . i
1.3.3. Субстратная специфичность и кинетические свойства
1.3.4. Регуляция экспрессии .
1.3.4.1. Регуляция транскрипции iv оперона
1.3.4.2. Регуляция транскрипции iv оперона.
1.3.4.3. Регуляция транскрипции ivIоперона.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Среды, условия культивирования штаммов
2.2. Трансформация, трансдукция бактерий, ишчлрация эксирессионных кассет
2.3. Хромосомные модификации с использованием записимой системы интеграции линейных фрагментов ДНК
2.4. Бактериальные штаммы, использованные в данной работе
2.5. Эксперименты с рекомбинантной ДНК.
2.6. Конструирование рекомбинантных плазмид
2.7. Условия измерения методами ТСХ и ГЖХ
2.8. Анализ деградации Ьи,4Стреонина в штамме I.
2.9. Получение ЬСтреонина
2 Регистрация и обработка ЯМРспектров.
2 Измерение энзиматических активностей.
. Определение активности треониндезаминазы
. Определение активности ацстолактатсинтазы.
. Определение активности изопропилмалатсинтазы
2 Определение времени полужизни треониндезаминазы и II
2 Идентификация и анализ накопления норвалина и норлейцина.
2 Определение минимальных ингибирующих конценграций МИК аминокислот
2 Анализ образования норвалина и норлейцина покоящимися клетками . i.
2 Компьютерные программы, использованные в данной работе.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение аэробной деградации треонина в модельном штамме I в условиях контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию.
3.1.1. Конструирование модельного штамма I.
3.1.2. Изучение конверсии треонина в изолейцин в модельном штамме 1ТР в условиях контролируемой экспрессии гена iv,.
3.1.3. Анализ продуктов дшрадации ЬиСтреонина в штамме I.
3.1.4. Анализ продуктов дшрадации ЬСтреонина методом ЯМРспектроскопии
3.2. Изучение ферментов пути аэробного метаболизма треонина в пропионат
3.2.1. Влияние амплификации и инактивации генарохВ на синтез пропионата в штамме I .
3.2.2. Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме I.
3.2.3. Изучение возможного метаболизма пропионилКоА в мстилцитратном цикле.
3.3. Модификация экспрессии ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот
3.3.1. Клонирование генов II под контролем регуляторной области iv оиерона
3.3.2. Клонирование генов валинчувствительиых II I и III.
3.3.3. Клонирование генов АН I в составе оиерона РглАаП
3.3.4. Клонирование генов I I из М. .
3.4. Изучение сверхсинтсза иорвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма
. i, дефектного по .
3.4.1. Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом 7ivivivI
3.4.2. Подтверждение предполагаемого пути биосинтеза норвалина и норлейцина
3.4.3 Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками . i с разным
уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина.
3.4.4. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей I.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме I. Изучение возможного метаболизма пропионилКоА в мстилцитратном цикле. Клонирование генов валинчувствительиых II I и III. Клонирование генов I I из М. Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками . Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей I. Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроор1анизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути скрытого метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения 1. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммовпродуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование ненужных путей. Эго достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. Мы столкнулись с явлением скрытого метаболизма при конструировании на основе ii i штаммапродуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина Рис. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина биосинтетической треониндезаминазы Iv, осуществляющей превращение треонина в 2кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот 1I, которые катализируют конденсацию 2кетобутирата с пируватом с образованием 2ацето2гидроксибутирата предшественника изолейцина. При создании штаммапродуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Рис. Метаболизм трсошша в . К настоящему времени в клетках . ЗкетобутиратКоАлигаза КЫ 2, и анаэробная деградация до пропионата 3 Рис. Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2кетобутират иод действием биодеградативной треоииидезаминазы . Затем 2кстобутират неокислительно декарбокснлирустся с образованием пролионилКоА фомиатлиазами кетокислот и , которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионилКоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза и пропионаткиназы и . Другие нуги деградации треонина в клетках . Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО АГРИ и направленных на конструирование высокоэффективных пггаммовпродуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках . II из . В настоящей работе изучена аэробная деградация треонина, однородно меченного изотопами С и ЬС, в модельном штамме . I. Этот штамм накапливает треошш в отсутствие экспрессии гена ivI, кодирующего биосинтетическую трсониидезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ivI. Установлено, что основную роль в деградации 2кстобугирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае сс сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2кетобутирата является незначительным. Создана коллекция экснрессионных кассет, кодирующих изоферменгы синтаз ацетогидроксикислот . М. . Получены варианты оперона iv3 и iv . Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммовпродуцентов разветвленных аминокислот. Получен штамм . На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках .