Анализ роли дистальных доменов десмоглеина 3 человека в нарушении адгезии между кератиноцитами при пузырчатке

• Автор: Лысенко, Андрей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Аутоиммунное заболевание пузырчатка

Роль аутоантител в патогенезе пузырчатки

Внутриклеточные сигнальные пути и их роль при пузырчатке

Изменение качественного и количественного состава десмосом вследствие действия ВП 1 дСт

Эксперимен тальные модели для исследования патогенности аутоантител

I антитела к десмоглеинам основной класс антител, обнаруживаемых в сыворотке больных пузырчаткой

Генетические предпосылки, обуславливающие развитие пузырчатки

Структура и функции десмосом

Молекулярная архитектура десмосом

Десмосомальные кадгерины
Адгезионные взаимодействия между десмосомальными кадгеринами
Механизм образования димеров по типу якорькарман
i и димеры функциональная роль и механизм формирования
Специфичность адгезии, опосредованной кадгеринами
Адгезионные взаимодействия в десмосоме
Динамика формирования десмосом
Роль 2 в формировании и функционировании десмоомальных контактов.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 1. Материалы и методы исследований
Система для получния рекомбинантных белков в бакуловирусной системе экспрессии
Получение генетических конструкций, кодирующих разные домены десмоглеина 3 человека
Праймеры
Приготовление компетентных клеток для трансформации рекомбинантными векторами
Трансформация клеток . i штамма Вас векторами, кодирующими разные фрагменты десмоглеина 3 человека
Выделение плазмидной ДНК из клеток . i
Трансфекция клеток насекомых линии 9 рекомбинантной вирусной бакмидой
Реамплификация вирусного стока
Определение титра рекомбинантных вирусов
Выделение белков с исползованием метода iаффиной хроматографии
Электрофорез в полиакриламидном геле
Иммуноблоттинг
Твердофазный иммуноферментный анализ ИФА
Выделение из сыворотки иммунных кроликов и больных вульгарной пузырчаткой
Выделение фракции I из раствора эуглобулинов
Анализ участия I из сывороток иммунных кроликов в акантолизе кожи,
Антитела, использованные в работе
Приготовление криосрезов из образцов человеческой кожи
Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов кожи и клеток линий А1 и НаСаТ.
ГЛАВА 2. Получение в бакуловирусной системе экспрессии рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам десмоглеина 3 человека
2.1. Экспрессия генов Д1, Д2, Д и Д доменов ДСГЗ в бакуловирусной системе
2.2. Получение рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам ДСГ 3 человека
2.3. Распознавание различных доменов ДСГЗ сыворотками больных пузырчаткой
2.4. Идентификация Вэпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой
2.5. Моделирование конформационных эпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой
ГЛАВА 3. Индукция акантолиза антителами к доменам и ДСГЗ человека
3.1. Получение кроличьих антител к ДСГЗ
3.2. Идентификация эпитопа ДСГЗ, распознаваемого коммерческими моноклональными антителами
3.3. Характеристика клеточных линий кератиноцитов человека
3.4. Характеристика экспрессии молекул адгезии в неонатальном эпидермисе человека
3.5. Роль антител к различным доменам ДСГЗ в нарушении адгезии между кератиноцитами
3.5.1. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к дистальным доменам Д ДСГЗ
3.5.2. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к проксимальным доменам Д ДСГЗ
3.6. Связывание антител к ДСГЗ с монослоем кератиноцитов человека линии НаСаТ
ГЛАВА 4. Роль ионов кальция в межклеточной адгезии и ее нарушениях
4.1. Зависимость адгезии в клетках НаСаТ разной степени плотности от ионов кальция
4.1.1. Плотность дссмосом на мембранах гиперадгезивных и адгезивных кератиноцитов
4.1.2. Зависимость адгезии в гиперадгезионных клетках НаСаТ от концентрации ионов кальция
4.1.3. Зависимость адгезии в монослое клеток НаСаТ от концентрации кальция
4.2. Роль синтеза десмосомальных кадгеринов v в сохранении гиперадгезии клеток ПаСаТ
4.3. Роль температуры в сохранении адгезии клеток НаСаТ
4.4. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция
4.5. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция и комнатной температуре
4.6. Механизм нарушения адгезии между кератиноцитами
4.7. Различия механизмов действия антител к Д и ДЗ5
4.8. Плотность десмосом на кератиноцитах кожи человека
4.9. Патогенные антитела к десмоглсину 3 уменьшают число десмосом в сунрабазальном слое кератиноцитов кожи
ОБСУЖДЕНИЕ
Выводы
Благодарности
Список литературы


В отличие от ряда других аутоиммунных заболеваний, поражающих преимущественно женщин, пузырчатка наблюдается у обоих полов равномерно и чаще всего диагностируется между сорока и шеегндесятыо годами. При ВП выделяют две основные формы мукозальную, при которой поражаю гея только эпителий слизистых оболочек, п кожномукозальную, где поражаются также кожные покровы. Акантолиз при ВП наблюдается в базальном и шиповатом слое эпидермиса. В обоих случаях заболевание обычно начинается с образования болезненных, не заживающих язв не только на слизистых, но и в гортани, носу. Позже могут появиться водянистые пузыри на коже головы, в паху, подмышечных впадинах, которые легко вскрываются, оставляя резко очерченные эрозии, заживающие без образования рубцов. При ЛП акантолиз наблюдается преимущественно в верхних слоях эпидермиса, на уровне зернистого слоя, и поражается только эпителий кожи, что приводит к образованию язв, покрытых корочками. Поэтому образование слоистых чешуек и корок считается характерным для ЛП. Одной из причин развития пузырчатки может быть употребление лекарств, таких как пенициламин, пенициллин, каптоприл и блокаторьт. В Южной Америке существует эндемичная форма ЛП, называемая v. Считается, что в се распространении определенную роль играют насекомыепереносчики . В настоящее время терапия пузырчатки основана на иммуносупрессии и уменьшении количества аутоантител в крови. Традиционная терапия включает в себя v высокие дозы кортикостероидов, внутривенное введение иммуноглобулинов и цитотоксических лекарств. До применения подобной терапии больных ВП умирали в течение года. Однако, такая терапия связана с рядом осложнений от побочного действия высоких доз кортикостероидов. Для устойчивых форм пузырчатки применяют ixi, моноклональное антитело, направленное против рецептора Вклеток, что приводна к уменьшению антителопродуцирующих Вклеток . Для непосредственного удаления антител используют плазмафорез. Пузырчатка давно известна, как аутоиммунное заболевание. Еще в х было показано, что антитела и сыворотки больных пузырчаткой способны вызывать расслоение эпидермиса, формирование пузырей в коже человека i viv и i vi i i, . К концу х удалось идентифицировать аутоантпгены пузырчатки массой 0 кДа для ЛП и 0 кДа для ВП, экспрессирующиеся в коже и слизистых оболочках в составе десмосом . В начале х годов выдсленеие и клонирование кДНК позволило охарактеризовать эти белки как дссмоглеии 1 0 кДа и десмоглеин 3 0 кДа, относящиеся к семейству белков межклеточной адгезии кадгеринам . Эти белки были экспрессированы в различных системах экспрессии i. Iii . Пациенты, имеющие мукозальный тип ВП, имеют антитела только к ДСГ 3, но не к ДСГ 1. В то время как у пациентов е кожномукозальной формой заболевания имеются антитела к обоим типам белков i . Напротив, при ЛП выявляются антитела только к ДСП, но не к ДСГЗ i . Однако, известно, что в ряде случаев не обнаружено никакой корреляции между клиническим фенотипом заболевания и профилем аутоантител . В последнее десятилетие возникла серьезная дискуссия о роли антител при пузырчатке i . АнтиДСП и ДСГЗ I антитела обнаруживаются у пациентов с ЛП или ВП, но не у здоровых людей . Iii . При наблюдениях за пациентами титры антиДСГ или антиДСГЗ антител, измеренные с помощью непрямой иммунофлуорссценции или ИФА. Iii . Пациенты с мукозальным типом пузырчатки имеют только ан тиДСГЗ антитела. В то же время пациенты с кожномукозальным типом имеют антитела как к ДСГЗ, так и к ДСП i . У ряда пациентов наблюдается переход от одного тина ВГ к другому. Этот переход сопровождается изменением в антигенной специфичности аутоантител. Например, при переходе от ВП к ЛП к антиДСГЗ антителам добавляются антиДСГ антитела i . Антитела, выделенные у больных ЛП или ВП, при инъекции в неонатальных мышей могут вызвать акантолиз с гистологической картиной, характерной именно для ЛП или I I соответственно . Удаление антиДСГ I антител с помощью иммуноадсорбцин на рекомбинантных ДСП, экспрессированных в бакуловирусной системе, устраняет способность сывороток к формированию акантолиза i vi и при пассивном переносе в неонатальных мышей. То же самое показано для антиДСГЗ антител и больных ВП i .