Создание рекомбинантных антител человека против ортопоксвирусов с использованием методов фагового дисплея

• Автор: Юн, Татьяна Эверестовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МОЛЕКУЛ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

1.1.1 Общий план строения иммуноглобулинов

1.1.2 Гены иммуноглобулинов

1.1.3 Организация генов, кодирующих легкие цепи иммуноглобулинов

1.1.4 Организация генов, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулинов

1.1.5 Механизмы ДНК рекомбинации между V и Ттенами

1.2 ИНЖЕНЕРИЯ АНТИТЕЛ.
1.2.1 Химерные антитела
1.2.2 Гуманизированные антитела
1.2.3 Полноразмерные антитела человека.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Растворы
2.1.3. Ферменты
2.1.4. Олигонуклеотиды,
2.1.5. Культуральные среды.
2.1.6. Эукариотические клетки и бактерии.
2.1.7. Комбинаторная библиотека одноцепочечных рекомбинантных антител человека
2.1.8. Вирусы и бактериофаги.
2.1.9. Плазмиды
2.2 ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ.
2.2.1. Очистка ортопоксвирусов.
2.2.2 Амплификация фрагментов ДНК
2.2.3. Ферментативный гидролиз ДНК.
2.2.6. Выделение плазмидной фагмидной ДНК
2.2.7. Электрофоретическое фракционирование ДНК
2.2.8. Элюция фрагментов ДНК.
2.2 Электрофоретический анализ белков
2.2 Амплификация библиотеки
2.2 Аффинное обогащение библиотеки специфичными фаговыми антителами
2.2 Выделение фаговых антител
2.2 Анализ экспрессии всБу АТ в растворимой форме отдельными клонами библиотеки.
2.2 Приготовление субклеточных фракций Е.соИ.
2.2 Очистка одноцеиочечных антител с помощью хелатной хроматографии
2.2 Вестернблот анализ
2.2 Твердофазный иммуноферментный анализ.
2.2 Трансфекция эукариотических клеток плазмидными ДНК.
2.2 Очистка полноразмерных антител с помощью.
аффинной хроматографии.
2.2 Определение констант аффинности рекомбинантных антител
2.2 Исследование вируснейтрализующей активности фаговых антител против ортопоксвирусов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Получение препаратов ортопоксвирусов
3.2. Отбор миниантител против вируса натуральной оспы, штамм 1пс13а из синтетической библиотеки
3.3. Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих отобранные одноцепочечные антитела против ВНО, штамм 1п13а.
3.4. Исследование связывания отобранных фаговых антител с различными ортопоксвирусами
3.5. Исследование вируснейтрализующих свойств отобранных рекомбинантных антител.
3.6. Получение одноцепочечных антител человека в растворимой форме
3.7 Исследование особенностей продукции растворимых антител
3.8 Определение констант аффинности растворимых ясБуантител 1Б4,6,
3. Исследование продукции полноразмерного антитела человека
в эукариотической системе экспрессии.
3. Исследование иммунохимических свойств полученных полноразмерных антител против ортопоксвирусов
3. Исследование вируснейтрализующих свойств, полученных полноразмерных рекомбинанатных антител.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В исследованиях, проводимых с использованием инфекционного вируса натуральной оспы в условиях специальной лаборатории с уровнем защиты 34, вместе с автором принимали участие А. А. Гуськов, Е. Б. Сокунова, Е. В. Жираковская, В. В. Морозова, Е. И. Бовшик, Н. В. Тикунова. Тестирование антител на наличие вируснейтрализующей активности проводилось в лаборатории общей вирусологии, руководитель к. Е.Ф. Беланов, в тестировании антител принимали участие вместе с автором Н. И. Бормотов и З. Ф. Киселева. Конструирование полноразмерных антител и эксперименты по эукариотической экспрессии проводились совместно с сотрудниками лаборатории инженерии белка и группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки института Биоорагнической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН г. Москва к. Л.Н. Шингаровой и к. И.В. Мерсияновой. ГЛАВА 1. Иммуноглобулины антитела представляют собой группу гликопротеинов, которые содержатся в плазме крови и тканевой жидкости у всех млекопитающих. Синтез антител АТ осуществляют Вклетки, но для этого им необходим контакт с антигеном и вызванное им созревание в антитслообразующие клетки плазмоциты. При анализе структуры и функции иммуноглобулинов различают два понятия гетерогенность и вариабельность. Гетерогенность определяет свойства иммуноглобулинов, обусловленные константной С частью молекулы. Гетерогенность подразумевает также различия в фнкциональной активности разных классов иммуноглобулинов за исключением их свойства специфического взаимодействия с антигеном. Вариабельность это индивидуальная характеристика иммуноглобулинов, относящихся к одному и тому же подклассу. Она проявляется в специфической антигенвязующей активности и обусловлена меняющейся от белка к белку последовательностью аминокислотных остатков Ыконцевой части молекулы. Основная структурная единица молекулы иммуноглобулина любого класса состоит из двух идентичных легких Ьцепи и двух идентичных тяжелых Нцепи полипептидных цепей, удерживаемых вместе дисульфидными связями рис. А Ройт, . От типа тяжелых цепей зависит принадлежность молекулы иммуноглобулина к тому или иному классу и подклассу. Галактионов, . В качестве типичного иммуноглобулина можно рассматривать молекулу рис. А. Эти клубки названы доменами рис. Б Галактионов, 2ООО Роит, . Изучение полной аминокислотной последовательности различных белков позволило выяснить, что концевые участки Н и цепей довольно разнообразны, в то время как Сконцевые участки относительно консервативны. Таким образом, на конце Нцепи имеется вариабельный участок Уц длиной примерно 5 аминокислотных остатков а. Соответственно, и у цепей есть концевой вариабельный участок V длиной примерно 0 аминокислот. Сконцевые части цепей 0 аминокислот и Н цепей 0 а. С и Си, соответственно. Тяжелая цепь содержит три константных домена Сн1, Сн2, СнЗ. Пол, . В пределах самой вариабельной области легких и тяжелых цепей три участка являются наиболее вариабельными, образуя по три гипсрвариабсльных сегмента, i i. Менее вариабельные области, чередующиеся с , называют каркасными, i областями Галактионов, , . Каждый домен молекулы иммуноглобулина состоит из двух слоев с рскладчатой структурой, один из которых построен из четырех антипараллельных сегментов цепи, а другой из трех. Вся эта глобула, имеет гидрофобное внутреннее ядро. Слои ковалентно связаны дисульфидиым мостиком примерно в середине домена рис. Б. Образующие эту связь цистеины эволюционно стабильны они имеются в молекуле каждого иммуноглобулина, а также родственных им белков, например, 2микроглобулина, а также в некоторых участках а Угол между главными осями V и Сдоменов в легких цепях больше обычно 00, тогда как угол между осями Vдомена и первого Сдомена Сн1 в тяжелой цепи меньше обычно , , Пол, . Биологические функции иммуноглобулинов находятся в зависимости от четвертичной структуры.