Диагностика полиморфизма гена ТПМТ и наследственных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2

• Автор: Громыко, Ольга Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 168 с. : ил.

Оглавление

Список использованных сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

Раздел 1. Полиморфизм тиопурин8метилтрансферазы ТПМТ.

1.1. Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека.

1.2. Фермент ТПМТ, его основные свойства и функции в клетке

1.3. Генетический полиморфизм гена ТПМТ человека.

1.3.1. Структура и функции гена ТПМТ

1.3.2. Полиморфные аллели гена ТПМТ.

Раздел 2. Мутации в генах ВЯСА и СНЕК2 и наследственный РМЖ и

2.1. Эпидемиология РМЖ и РЯ
2.1.1. Заболеваемость и смертность от РМЖ и РЯ в мире.
2.1.2. Факторы риска развития РМЖ и РЯ
2.2. Наследственные синдромы предрасположенности к РМЖ и РЯ
2.3. Гены предрасположенности к РМЖ и РЯ.
2.3.1. Высоко и низкопенетрантные гены предрасположенности к
РМЖ и РЯ
2.3.2. Гены ВЯСА1 и ВСА2, их структура и функции их белковых продуктов
2.3.3. Ген СНЕК2, его структура и функции белкового продукта
2.4. ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2 мутации
2.4.1. Основные типы мутаций в генах ВЛСАТ ВЯСА2 и СНЕК2 ассоциированные с риском развития РМЖ и РЯ.
2.4.2. Спектр и частота мутаций ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2 генов
в различных популяциях мира.
2.4.3. Риск развития РМЖ и РЯ для носителей мутаций
в генах ВЯСА1, ВЯСА2 и СНЕК2
2.4.4. Молекулярнопатологические особенности ВЯСАассоциированных опухолей МЖ и яичников.
2.4.5. Основные подходы к профилактике онкозаболеваний
для носителей ВЯСА I, ВЯСА2 и СНЕК2 мутаций.
Раздел 3. Молекулярногенетические методы диагностики мутаций в генах человека.
3.1. Основные молекулярногенетические методы,
применяемые для диагностики мутаций в генах ВЯСА и СНЕК2
3.2. ДНКбиочипы история создания, типы, применение.
3.2.1 История создания и основные типы ДНКбиочипов,
применяемых в настоящее время.
3.2.2. ДНКбиочипы на основе трехмерных ячеек геля и их основные приложения
Глава И. Материалы и методы
1. Клинический материал
2. Экстракция геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови
3. Изготовление биочипов.
3.1. Синтез олигонуклеотидных проб
3.2. Технология производства биочипов.
4. Проведение ПЦР
4.1. Синтез олигонуклеотидовпраймеров
4.2. Амплификация фрагментов ДНК
4.3. Визуализация продуктов ПЦР в агарозном геле
5. Гибридизация меченого продукта ПЦР на биочиие.
6. Регистрация и анализ полученных результатов гибридизации
7. Секвенирование ДНК
8. Статистическая обработка данных.
Глава III. Результаты и их обсуждение
Раздел 1. Диагностика полиморфизма гена ТПМТ,
1.1. Подготовка образца ДНК для анализа.
1.1.1. Выбор метода подготовки образца ДНК.
1.1.2. Подбор системы праймеров для проведения двухэтапной ПЦР.
1.1.3. Выбор оптимального температурновременного режима ПЦР.
1.1.4. Оптимизация химического состава реакционной смеси ПЦР
1.2. Разработка ТПМТбиочипа
1.2.1. Выбор полиморфных вариантов в гене ТПМТ для анализа на биочипах.
1.2.2. Подбор дискриминирующих олигонуклеотидов для идентификации олигонуклеотидных замен в гене ТПМТ человека и разработка схемы ТМПТбиочипа
1.2.3. Подбор оптимальных физикохимических параметров гибридизации на биочипе
1.2.4. Оценка точности и чувствительности метода.
1.3. Генотипирование пациентов
Раздел 2. Диагностика наследственных мутаций в генах ВСА и СНЕК2
2.1. Подготовка образца ДНК для анализа
2.2. Разработка РМЖбиочииа.
2.2.1. Выбор генов и мугаций.
2.2.2. Подбор олигонуклеотидов и разработка схемы РМЖбиочипа.
Подбор оптимальных физикохимических параметров гибридизации
2.2.3. Оценка точности и чувствительности метода.
2.3. Диагностика наследственных форм РМЖ и РЯ у больных РМЖ, РЯ и ПМЗН
2.3.1. Анализ частоты мутаций в генах ВЯСА и СНЕК2 у больных РМЖ,РЯиИМЗН
2.3.2. Взаимосвязь наличия мутаций в генах ВКСА1, ВЯСА2 и СНЕК2 возраста начала заболевания.
2.3.3. Взаимосвязь наличия мутаций в генах ВЯСА и СНЕК
и семейной истории заболевания.
Заключение
Выводы
Список использованной литературы


Исследования, проведенные на выборках пациентов с диагнозом РМЖ смешанных по возрасту и семейной истории заболевания, были посвящены анализу частоты только двух мутаций твС в гене ВЯСА1 и О0с1е1С в гене СНЕК2. Это вызывает необходимость проведения дополнительного исследования частоты различных мутаций в генах ВЯСА и СНЕК2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке для выявления доли наследственных форм в общей структуре заболеваемости. Цслыо работы является разработка методов диагностики полиморфизма гена ТПМТ, связанного с недостаточностью фермента ТПМТ, и мутаций в генах ВЕСА и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ и РЯ, с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов. Разработать метод аллельспецифичной гибридизации на биочипе для анализа шести наиболее распространенных в мировых популяциях точечных полиморфных вариантов в гене ТПМТ Э8С, С2Т, С0А, Э4А, ТЮ, А9Э. Определить частоты генотипов и аллелей гена ТПМТ у детей с гемобластозами и здоровых доноров, жителей Европейской части России, используя разработанный ТПМТбиочип, и сравнить их с таковыми в популяциях других стран. Разработать метод аллельспецифичной гибридизации на биочипе для анализа семи наиболее распространенных в популяциях Восточной Европы точечных мутаций в генах ВКСА и СНЕК2 5с1е1ЛО, 0ТС, с1е1А и тБС в гене ВЯСА1, 5тяТ и йе1Т в гене ВКСА2, мутация 1 ЮОйеЮ в гене СНЕК2 и полиморфизма АС в гене ВЯСА1. Провести исследование частот этих мутаций и полиморфизма в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке пациентов, жителей Европейской части России, с диагнозом РМЖ, РЯ и ПМЗН и определить долю наследственных форм рака в общей структуре заболеваемости. Провести сравнение частоты наиболее распространенных мутаций в генах 2 и СНЕК2 у жителей Европейской части России и стран Европы. Проанализировать семейный анамнез пациентовносителей мутаций в генах и СНЕК2. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 0 источников. Работа изложена на 8 страницах машинописного текста, содержит рисунка и таблиц. Глава I. Раздел 1. Полиморфизм тиопурин8метилтрансферазы ТПМТ. Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека. Тиопурины 6меркаптопурин, 6тиогуанин и азатиоприн широко используются н медицинской практике как противоопухолевые и иммуносупрессорные агенты рис. Рис. Химическая структура препаратов тиопуринового ряда а 6меркаптопурин б 6тиогуанин а азатиоприн. Меркаптопурин 6МП важный компонент, входящий в состав большинства современных средств лечения острого лимфобластного лейкоза I1 v , . МП составляет существенную долю от всех лекарственных средств, используемых при лечении этого заболевания. Его применяют ежедневно в течение 2,5 лет. Общепринятые схемы терапии позволяют вылечивать более детей с II. Наряду с 6МП, для лечения ОЛЛ, а также острого миелобластного лейкоза ОМЛ, хронического миелолейкоза ХМЛ и псориаза, применяют лекарственные препараты па основе 6тиогуанина 2амино6меркаптопурин, 6ТГ Т. Азатиоприн Метил4нитроимидазолил5меркаптопурин, АЗА применяют в терапии аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит i , , аутоиммунный гепатит . МП и ею аналоги являются антиметаболитами пуринов. Являясь структурным аналогом
антиметаболитом этих соединений, входящих в состав нуклеиновых кислот ДНК, РНК, 6МП нарушает биосинтез нуклеотидов, подавляет рост пролиферирующих тканей и оказывает цитотоксическое влияние путем включения 2дезокси6тиогуанозинмонофосфата в ДНК. Сами по себе они не обладают антипролиферативной активностью, а действуют опосредованно, то есть приобретают активность в результате метаболитической трансформации . Как показали ранее проведенные исследования, существует три пути биотрансформации данных лекарственных препаратов в организме рис. Крынецкая Н. Ф. и . ТПМТ. При метаболизме с участием гипоксантинфосфорибозилтрансферазы КФ 2. МП первоначально превращается в 6тиоинозинмонофосфат . В. , . КФ . Рис. Метаболизм 6МП в клетках человека.