Взаимодействие экзогенной гомологичной ДНК с изолированными клеточными ядрами из проростков кукурузы

• Автор: Топтиков, Валентин Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Одесса
• Количество страниц: 229 c. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. Метода идентификации экзогенной ДНК .

1.2. Поглощение ДНК растительной клеткой .

1.3. Механизм проникновения ДНК в растительную

клетку

1.4. Состояние экзогенной ДНК в клетке и взаимодействие ее с реципиентным геномом .

1.5. Заключение. Выбор модельной растительной

системы

ГЛАВА 2. Материал и метода

2.1. Материал

2.2. Выделение ядерной фракции из проростков и
анализ полученных препаратов .
2.2.1. Выделение ядер.
2.2.2. Оценка препаратов ядер.
2.3. Выделение ДНК
2.3.1. Выделение ДНК из проростков
2.3.2. Выделение ДНК из изолированных ядер . .
2.4. Метода исследования и модификации ДНК . .
2.4.1. Спектрофотометрирование .
2.4.2. Электрофорез
2.4.3. Фрагментирование.
2.4.4. ДНКазнал обработка препаратов
2.4.5. Иодирование
2.4.6. Обработка ДНК актиномицином Д
2.5. Методы изучения поглощения Нтимидина проростками
2.5.1. Определение динамики включения в ДНК . .
2.5.2. Определение эффективности использования пог
лощенного тимидина в синтезе ДНК
2.6. Иммунологические методы.
2.6.1. Препараты для иммунизации
2.6.2. Иммунизация животных и получение антисывороток
2.6.3. Реакция связывания комплемента
2.6.4. Осаждение комплекса ДНКантитело сульфатом аммония.
2.7. Определение поглощения ДНК изолированными
ядрами
2.8. Определение распада эндогенной ДНК в ядрах .
2.9. Определение радиоактивности.
2 Математическая обработка данных
ГЛАВА 3. Характеристика донорного материала ДНК и реципиента изолированных клеточных ядер
3.1. ДНК.
3.2. Характеристика препаратов ядер
3.3. Изучение состояния изолированных ядер при длительной экспозиции.
ГЛАВА 4. Разработка методов идентификации экзогенной ДНК
4.1. Мечение ДНК
4.1Л. Подбор концентраций основных ингредиентов
среды.
4.1.2. Динамика включения и эффективность использования 3Нтимидина в синтезе ДНК. Влияние аминоптерина и удаления эндосперма
4.1.3. Обсуждение. .
4.1.4. Метод мечения Нтимидином ДНК проростков кукурузы
4.2. Иммунологическое изучение ДНК
4.2.1. Изучение специфичности к ДНК полученных антисывороток .
4.2.2. Изучение видовой иммуноспецифичности . .
4.2.3. Обсуждение
4.3. Методы идентификации экзогенной ДНК . . .
ГЛАВА 5. Взаимодействие ДНК с изолированными ядрами . .
5.1. Динамика поглощения и состояния экзогенной гомологичной ДНК
5.1.1. Анализ методики определения поглощения ДНК
5.1.2. Динамика поглощения ДНК.
5.1.3. Сохранность и состояние поглощенной НДНК
в ядрах.
5.1.4. Изменение ДНКазной активности ядер при инкубации.
5.1.5. Обсуждение
5.2. Изучение механизма проникновения ДНК в изолированные ядра.
5.2.1. Кинетика поглощения НДНК
5.2.2. Влияние некоторых химических агентов на кинетику поглощения нативной ДНК
5.2.3. Влияние температуры на поглощение нативной
5.2.4. Зависимость поглощения ДНК от ионной силы инкубационной среды.
5.2.5. Изучение скорости и стадий поглощения нативной ДНК изолированными ядрами . . .
5.2.6. Обсуждение
5.3. Изучение возможности экспрессии экзогенной ДНК
5.3.1. Влияние экзогенной гомологичной ДНК на транскрипционную активность ядер
5.3.2. Влияние экзогенной ДНК на выход метки из 3Нядер.
5.3.3. Обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ
ЛИТЕРАТУРА


Ценность этих методов заключается в том, что они позволяют делать четкие выводы о сохранении биологической активности экзогенной ДНК. Однако, они ограничивают крут доноров бактериями и вирусами. Метод чувствителен и позволяет определять бактериальной ДНК в ДНК обработанных растений. Зависимость трансформирующей активности препарата от того, интегрирована ли донорная, маркерная ДНК в растительный геном или нет, и влияние размеров ДНК на ее трансформирующую активность трудно точно учесть, что придает некоторую условность данной количественной оценке. Подытоживая, можно отметить, что наиболее широкие методические возможности открываются на пути упрощения донорного материала, при использовании в качестве последнего индивидуальных последовательностей ДНК. При поиске других путей идентификации экзогенной ДНК заслуживают внимания методы иммунологического анализа ДНК см. Относительно последнего можно отметить, что поведение ДНК в двухфазных системах обнаруживает зависимость от структуры и нуклеотидного состава, и этот метод уже использовался для отделения одноцепочечной ДНК от нативной ПерОке Альбертсон, . Широко применяется подход, который собственно не связан с непосредственной идентификацией ДНК, но служит очень важным доводом в пользу присутствия донорной ДНК в реципиенте. Этот подход связан с определением специфических продуктов кРНК и белков. Ценность его состоит в том, что он дает ответ на решающий, по сути дела, вопрос о возможности функционирования донорного материала в чужеродной системе. Для изучения генетической трансформации высших растений в первую очередь интерес представляет вопрос о проникновении ДНК в растительную клетку. В опытах i viv экзогенная ДНК обнаруживается в тканях различным образом обработанных растений. При использовании в качестве донорного материала гетерологичной бактериальной или фаговой ДНК это показано на разных объектах арабидопсисе Во . Сиволап и др. По вопросу о проникновении гомологичной ДНК в растения, хотя он сопряжен со многими методическими сложностями, также имеется ряд работ Аблов, Картель, Картель, , . Показано влияние на поглощение тканями ДНК температуры Картель, , освещения . ЭДТА , i, , АТФ . ДНК x, , , эндогенного синтеза ДНК . Сиволап И др. ДНК может накапливаться в определенных органах и впоследствии перемещаться в другие части растения . Относительно сохранности чужеродного материала имеются работы, свидетельствующие о сильной его деградации i, i, i, x, i, . Тем не менее, несмотря на сильное разрушение чужеродной ДНК, Кляйнхофс i, обнаружил в корнях и щитке семени ячменя до геномов бактериальной ДНК на геном реципиента. ДНК в растениях i viv представляет интерес, особенно в тех случаях, когда изучали поглощение донорного материала реципиентом, которого не подвергали механическому воздействию разрезы, инъекции, приводящему к образованию искусственных отверстий в тканях, или не обрабатывали раствором серной кислоты. Природа этого явления не ясна, и в литературе нет определенных и непосредственных объяснений по этому поводу. Вопрос о том, проникает ли ДНК при обработке интактных растений в сами клетки и их ядра, остается в определенной мере спорным и не окончательно разрешенным. В ряде работ авторадиографически было показано, что после обработки растений меченой ДНК радиоактивность выявляется в области ядер Картель, x, . Другими исследованиями продемонстрирована локализация метки лишь в межклетниках и проводящих сосудах , i, . Но и в случае положительного результата при определении метки в области ядер нет уверенности в том, что выявляемая радиоактивность связана с полимерным донорным материалом, а не является следствием накопления продуктов распада. Различия в накоплении растениями полимерного материала и его низкомолекулярных продуктов нуклеозиды, гидролизаты не могут выступать безоговорочным аргументом в пользу поглощения ДНК, так как эти различия могут быть обусловлены собственно процессом деструкции высокополимерного материала. Такой сравнительный анализ приобретает большую убедительность в случае, когда он проводится на фоне определения влияния различных факторов на накопление соединений.