Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей

• Автор: Шулепко, Михаил Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТОКСИНОВ И НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА

1.1. Никотиновый ацетилхолиновып рецептор.

1.2. Механизм активации канала нАХР

1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора.

1.4. Нейротоксины из яда змей

1.5. Взаимодействие лигандов нАХР с рецептором и ацетилхолннсвязывающим

1.5.1. Структура лигандсвязывающего сайта ацетилхолннсвязывающего белка

1.5.2. Взаимодействие агонистов нАХР с ацетилхолннсвязывающим белком
1.5.3. Взаимодействие антагонистов с нАХР и с ацетилхолннсвязывающим белком
Глава 2. ПОЛУЧЕНИЕ аНЕЙРОТОКСИНОВ I VI
2.1. Введение
2.2. Продукция нейротоксинов в виде гибридных белков в Е.соН.
2.3. Прямая экспрессия генов нейротоксииов в Е.соН.
2.4. Секреция неротоксинов в Е.соН.
ЧАСТЬ П. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Материалы
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.
3.1.2. Штаммы
3.1.3. Плазмидные вектора
3.1.4. Питательные .среды для роста бактериальных культур
3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.
3.2. Методы
3.2.1 .Общие молекулярногенетические методы.
3.2.2. Конструирование химерных длинных анейротоксинок
3.2.3. Экспрессия генов химерных токсинов в секрстирующсй консфукции.
3.2.4. Выделение и очистка секрстируемых нейротоксинов.
3.2.5. Анализ локализации рекомбинантных белков
3.2.6. Получение конструкций для бактериальной продукции слабого токсина X
3.2.7. Секреция слабого токсина
3.2.8. Продукция слабого токсина в виде слитной полипептндной цепи с тиоредокешюм
3.2.9. Выделение и очистка гибридного белка
3.2 Продукция слабого токсина в виде тел включения в клетках . i.
3.2 Отмывание телец включения
3.2 Очистка слабого токсина из тел включения.
3.2 Ренатурацияслабого токсина
3.2 ВЭЖХ нейротоксииов.
3.2 Методы структурных исследований
3 Спектры 1НЯМР.
3 Получение двумерных и трехмерных гетероядерных ЯМРснектров
3.2 Методы биологических исследований
3 Ингибирование химерными анейротоксинами ионных токов в ооцптах
X vi
3 Взаимодействие рекомбинантного X с мембранами из электрического органа ската ii.
3 Взаимодействие рекомбинантного X с клетками , трансфецированными а7нАХР человека.
3.2 Моделирование химерных иейротоксинов и их комплексов с нАХР
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Исследование влияния точечной замены в центральной петле длинных а
нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР аЗр2 типа.
4.1.1. Конструирование химерных длинных анейротоксинов
4.1.2. Биосинтез, выделение и очистка III и III
4.1.3. Анализ физикохимических свойств III и III
4.1.4. Исследование пространственной структуры химерных анейротоксинов
4.1.5. Исследование биологической активности химерных токсинов.
4.1.6. Моделирование комплексов химерных токсинов с нАХР.
4.2. Структурнофункциональные исследования слабого токсина и его мутантных
4.2.1. Экспрессирующие конструкции для продукции слабого токсина.
4.2.2. Биосинтез слабого токсина и его мутантных форм
4.2.3. Ренатурация слабого токсина из телец включения
4.2.4. Анализ рекомбинантного слабого токсина
4.2.5. Анализ пространственной структуры рекомбинантного слабого токсина.
4.2.6. Исследование биологической активности слабого токсина.
4.2.7. Конструирование и исследование биологической активности мутантных вариантов слабого токсина
4.2.8. ЯМРанализ влияния точечных мутаций слабого токсина на конформационную гетерогенность.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Изучение лигандрецепторных взаимодействий является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии и биофизики. Эти взаимодействия играют центральную роль во многих процессах, таких как гормональная регуляция, межклеточная сигнализация, транспорт биомолекул, передача нервного импульса и др. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор нАХР представляет собой лигандзависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов, и является одним из наиболее распространенных рецепторов центральной и периферической нервных систем млекопитающих. В зависимости от локализации рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса мышечные и нейрональные. Нейротоксины яда змей известны как высокоспецифичные конкурентные ингибиторы нАХР. Эти белки имеют характерную трехпетельную 3структуру, стабилизированную дисульфидными связями. Небольшие размеры и жесткая структура делают анейротоксины удобными инструментами для исследования свойств нАХР. Со структурной точки зрения анейротоксины из яда змей можно подразделить на 3 класса короткие, длинные и необычные нейротоксины. Короткие и длинные анейротоксины эффективно ингибируют нАХР мышечного типа, однако только длинные анейротоксины с пятой дисульфидиой связью в центральной петле эффективно взаимодействуют с нАХР нейронального типа. Мишенями действия необычных токсинов с пятой дисульфидиой связью, локализованной в Иконцевой петле, выступают как мышечные нАХР, так и нейрональные нАХР, а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к семейству Эбелок сопряженных рецепторов. АХР. Цель исследования. Целыо настоящей диссертационной работы являлось получение методами генной и белковой инженерии апсйротоксинов длинного и необычною типов, их мутантных и изотопномеченых вариантов, а также выявление структурных детерминант, важных для взаимодействия этих токсинов с различными подтипами нАХР. Основные задачи исследования. Получить гены химерных длинных анейротоксинов, созданных на основе нейрогоксина II из яда xii II путем введения в последовательность II дополнительных аминокислотных остатков, и слабого токсина из яда i X, xi, относящегося к классу необычных токсинов. Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных анейротоксинов, их мутантных и изотопномеченых вариантов. Наработать рекомбинантные анейротоксины, их мутантные и изотопномеченые варианты в необходимых для исследования количествах. Провести физикохимический анализ рекомбинантных белков. Исследовать биологические свойства химерных длинных анейротоксинов. Изучить специфичность химерных длинных аиейротоксинов по отношению к нейрональным нАХР и аЗр2 типов. Исследовать биологическую активность рекомбинантного X и его мутантных вариантов по отношению к мышечному и нейрональному нАХР типа. Идентифицировать аминокислотные остатки мутантных вариантов X, которые важны для взаимодействия с различными тинами нАХР. Исследовать влияние конформационной гетерогенности в молекуле X на функциональную активность. Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. На примере химерных длинных анейротоксинов впервые исследовано влияние точечной мутации в центральной петле длинных анейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР а3 типа. Впервые разработана эффективная система продукции слабого токсина из яда i. Впервые разработаны протоколы выделения и очистки рекомбинантного X. Впервые получены мутантные формы X, выявлены аминокислотные остатки токсина, важные для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального типов. Впервые получен 5Ммеченный X и проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах токсина. Впервые изучено влияние точечных мутаций X на конформационную гетерогенность молекулы токсина. Данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, будут интересны не только с точки зрения фундаментальной науки, но, в перспективе, также могут быть применены для разработки лекарственных препаратов, имитирующих свойства лигандов нАХР.