Исследование модельных и биологических мембран методом триплетных зондов

• Автор: Меклер, Владимир Маркович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Черноголовка
• Количество страниц: 153 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ Стр.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

I. Изучение поступательной диффузии молекул в

мембранах

2. Применение триплетных меток и зондов в биологических исследованиях

Глава П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I. Основные реактивы

2. Регистрация кинетики затухания замедленной

люминесценции

3. Липосомы и биологические мембраны

4. Встраивание зондов и меток в мембраны . .
5. Удаление кислорода из исследуемых растворов. 6. Обработка и интерпретация экспериментальных результатов по кинетике тушения триплетных
зондов в мембранах.
Глава Ш. ВЫБОР МЕМБРАННЫХ ТРИПЛЕТНЫХ ЗОНДОВ
I. Фосфоресцентные зонды .
2. Зонды испускающие аннигиляционную замедленную
флуоресценцию
Глава ГУ, ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАН
I. Зонды тушители триплетных молекул
2. Исследование локализации эритрозина в лило
сомах из яичного лецитина
3. Изучение диффузионной подвижности молекул в
липосомах.
4. Применение явления сенсибилизации замедленной флуоресценции для регистрации столкновений зондов в мембранах
Глава У. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ГЛЕТ.ШРАННЫХ СИСТЕМ
I. Изучение локализации активного центра Са,М зависимой АТазы в саркоплазматическом ретинулуме. . .
2. Исследование структуры белков липидного матрикса
мембраны саркоплазматического ре тику лума.
3. Изучение локализации хинонного кольца убихинона
й в липосомах из дипалъмитоилфосфатидилхоли на. НО 4. Изучение локализации гемовых групп цитохромов
Р0 и в микросомальной мембране.
5. Исследование межбелковых взаимодействий методом
триплетных меток .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Основой цредлагаемого метода является изучение кинетики дезактивации триплетных состояний зондов тушителями различной природы. Взаимодействия, приводящие к тушению, возникают в ходе диффузионных перемещений триплетных зовдов и тушителей. Поэтому в обзоре рассмотрены существующие экспериментальные методы изучения поступательной диффузии молекул в мембранах и основные области применения триплетных меток и зовдов в биофизических исследованиях в настоящий момент. Во второй главе описаны химические соединения, использованные в работе и методики основных измерений. В третьей главе рассмотрены свойства предложенных в работе фосфоресцентных и испускающих АЗФ триплетных зондов. В четвертой главе на примере изучения фосфатидилхолиновых липосом продемонстрированы возможности метода при изучении локализации и диффузионной подвижности мембранносвязанных объектов. Полученные в главе результаты сравниваются с литературными данными. В пятой главе приведены результаты исследования биологических мембранных систем. В этой части работы рассмотрены некоторые задачи, решение которых традиционными методами представляет значительные трудности или вообще невозможно. Исследовано расположение активного центра Са, М АТфазы саркоплазматического ретикулума относительно поверхности мембраны, локализация гемов цитохромов Р0 и в5 в микросомальной мембране и хинонного кольца Убихинона а в липосомах из ДПФХ. Получены новые данные о структурной организации белкакьлипидного матрикса мембраны саркоплазматического ретикулума. Оя, Па, АТфазы в мембранах СР. В заключении подводятся основные итоги проделанной работы и обсуждаются перспективы дальнейшего применения триплетных зондов и меток в исследованиях мембран. ГЛАВА I. Поступательное движение молекул в мембранах имеет большое значение для протекания многих биохимических реакций. Диффузионные перемещения являются необходимой стадией таких процессов, как перенос электронов в дыхательной цепи ,, рецептор медиаторные взаимодействия , перекисное окисление липидов , мембранный транспорт . Изучение поступательной диффузии вводимых в мембрану зондов дает информацию о структуре, динамике и вязкости мембран. Характер диффузионного движения зондов зависит от состояния мембраны. Это позволяет использовать данные о поступательном движении зонда. и т. Обычно выделяют два типа поступательных движений в мембранах латеральную диффузию и трансмембранные перемещения от одной поверхности мембраны к другой флипфлоппереходы. Небольшие гидрофобные молекулы свободно перемещаются как в латеральной плоскости, так и вдоль всей толщины неполярной части мембраны. Трансмембранные перемещения амфипатических молекул, таких как фосфолипиды и жирные кислоты, происходят гораздо медленней, чем латеральные. Например, среднее время флипфлопа перескока спинмеченого фосфатидилхолина в липосомах из яичного лецитина составляет 6,5 часов . За это время среднеквадратичное смещение фосфатидилхолина в латеральной плоскости составило бы несколько микрон. Такое расхождение , вообще говоря, является естественным. Известно, что характер диффузионного движения сильно зависит от соотношения формы и размеров молекул растворителя и диффундирующего соединения . Очевидно, что в такой сложной системе как мембрана зависимость диффузии от особенностей строения зонда может быть весьма резкой. Поэтому говорить о микровязкости мембраны как о какойто обобщенной характеристике не вполне корректно . При диффузии в мембране амфипатических соединений сопротивление их движению оказывают как молекулы мембраны, так и молекулы водного раствора. Зависимость коэффициента диффузии от вязкости растворителя в такой ситуации теоретически рассмотрена в работе . В настоящее время существует большое количество различных методов изучения поступательной диффузии молекул в мембранах. Большинство этих методов связано с применением оптической и магнитнорезонансной спектроскопии. При этом для изучения поступательной диффузии применяют два различных подхода.