Изучение молекулярно-механических свойств микротрубочек и развиваемых ими сил

• Автор: Молодцов, Максим Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 91 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Деление клетки и движение хромосом.

1.2 Современные представления о структуре и динамике микротрубочек.

1.2.1 Структура микротрубочка

1.2.2 Динамика микротрубочки

1.2.3 Структурная основа динамической нестабильности

1.3 Математические модели динамики и механики микротрубочек

1.3.1 Кинетические модели.

1.3.2 Сила, развиваемая микротрубочкой

1.3.3 Термодинамические оценки
1.3.4 Модели сопряжения микротрубочки с кинетохором.
1.4 Экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочками.
1.5 Измерение малых сил с помощью оптической ловушки
1.6 Постановка задачи.
ГЛАВА 2. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ
2.1 Описание модели.
2.2 Описание потенциалов продольных взаимодействий
2.3 Описание латеральных взаимодействий.
2.4 Полная потенциальная энергия МТ.
2.6 Расчет равновесной силы, развиваемой микротрубочкой.
2.7 Оценка жесткостей продольных и поперечных связей
2.8 Модель, используемая в эксперименте.
ГЛАВА 3. МЕТОДЫ.
3.1 Численный метод.
3.2 Линеаризация уравнений основной модели
3.2.1 Микротрубочка без спирачъности
3.2.2 Переход к другим переменным.
3.2.3 Модель одного протофиламента
3.2.4 Линеаризация уравнений равновесия.
3.3 Экспериментальные методы и материалы исследования.
3.3.1 Описание установки
3.3.2 Схема эксперимента
3.3.3 Приготовление тубулииа и нуклиирующих центров.
3.3.4 Проточная камера
3.3.5 Подготовка камеры к эксперименту
3.3.6 Обработка экспериментальных данных
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1 Стабильность МТ с Тшагжой и без
4.2 Баланс изгибающих сил в стенке микротрубочки
4.3 Локальность взаимодействий внутри стенки МТ.
4.4 Форма кончика микротрубочки.
4.5 Характеристика стабильности МТ
4.6 Параметры, влияющие на стабильность.
4.7 Разница между плюс и минус концами
4.8 Микротрубочка 3 немного менее стабильна, чем 0
4.9 Независимость главных выводов от параметров, описывающих силы
4. Катастрофа при наличии удерживающего кольца
4. Развитие силы протофиламентом
4. Влияние латеральных потенциалов на развитие сил
4. Оценка максимальной силы, развиваемой микротрубочкой
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1 Обсуждение теоретической части работы.
5.2 Обсуждение экспериментальной части работы.
ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Мы показали, что концы микротрубочек слегка изогнуты, не достаточно, чтобы это можно было увидеть при помощи электронной микроскопии, но достаточно для того, чтобы их могли узнавать специализированные белки. Мы показали, что баланс продольных взаимодействий в протофиламентах ответственен за стабильность основной часта микротрубочки, а не наличие поперечных связей. Мы проанализировали размер ГТФ шапки и нашли, что двух слоев ГТФ тубулина достаточно, чтобы стабилизировать микротрубочку любой длины в большинстве случаев. Усовершенствованная модель, которая описывает взаимодействие с сопрягающим устройством, позволила рассчитать максимальную силу, которую может развивать микротрубочка. Мы показали, что вся энергия, выделяемая в результате гидролиза молекул ГТФ во время полимеризации, может быть запасена в стенке микротрубочки и использована для генерации сил. Максимальное использование запасенной энергии достигается при развитии силы по механизму удара vv i. Максимальная сила составляет пН для полной микротрубочки. Эта сила достигается только при полной диссоциации латеральных связей димеров развивающих усилие. Если сопряжение достигается посредством кольца, то в диаметре оно должно быть на нм больше внешнего диаметра микротрубочки, для того, чтобы развиваемое усилие было максимально. Мы разработали и построили оптическую ловушку для того, чтобы непосредственно впервые измерить величину силы развиваемой микротрубочкой во время деполимеризации. Мы получили спектр развиваемых сил, разной величины. Максимальная развиваемая сила оказалась в точности равной рассчитанной теоретически. Механохимический механизм развития силы оказался уникальным молекулы тубулина, из которых состоят стенки микротрубочек, при полимеризации присоединяются к растущей трубочке в выпрямленной конформации, и в связанном с ГТФ состоянии. После полимеризации происходит расщепление ГТФ и выделившаяся энергия запасается в напряженном состоянии тубулина. При этом каждая молекула тубулина стремиться выгнуться наружу из стенки трубочки. Это напряжение, высвобождаясь в процессе деполимеризации микротрубочки, может развивать значительные силы и совершать работу по движению хромосом, если разбирающийся конец микротрубочки соединен с хромосомой соответствующим устройством сопряжения. Измеренная нами сила велика и составляет примерно десять сил, развиваемых единичным моторным белком. Из этого следует, что данный механизм может быть основным в движении хромосом во время митоза. Мы промоделировали эксперимент, модернизировав разработанную нами модель и нашли, что спектр различных амплитуд сил, наблюдаемых в эксперименте соответствует различным сценариям разрушения связей между нротофиламентами во время деполимеризации. Этот результат означает, что развитие силы на не симметричном устройстве, как это было у нас в эксперименте, может быть случайным образом снижено изза асинхрониости разборки микротрубочки. В некоторых из наших экспериментов в результате наличия натяжения продольные связи в протофиламентах существую дольше, чем обычно при разборке микротрубочек, стабилизируемые натяжением. Это может означать наличие специального механизма, который бы позволял сохранять соединение кинетохора с микротрубочкой в то время, когда сила, приложенная к хромосоме в стороны противоположенного полюса велика. Исследование механизмов деления клеток имеет принципиально важное значение для исследования развития раковых заболеваний. Понимание процессов протекающих во время митоза и их механизмов может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание важности и существенности динамики микротрубочек в движение хромосом во время деления. Построена оригинальная молекулярномеханическая модель микротрубочки. Рассмотрены различные механизмы сопряжения с передающим устройством. Сила, развиваемая микротрубочкой, измерена экспериментально. Ее величина составила пН, что находится в прекрасном согласии с теорией.