Исследование пространственной структуры трансмембранного домена проапоптозного белка BNIP3 методом спектроскопии ЯМР

• Автор: Пустовалова, Юлия Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 91 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. РОЛЬ МИТОХОНДРИЙ В АПОПТОЗЕ.

1.2. Белки семейства ВСЬ2

Аитиапоптозные белки

Проапотозные белки

1.3.ВМР З.

Смерть клеток при ишемии сердца.

Соеременное представление о структуре ВНРЗ.

Функция 1З.
1.4. Исследование мембранных белков методом спектроскопии ДМР.
Выдезениемембранных безков
Выбор окружения модезирующего мембрану
Закзючение.
ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Выделение ВЫ1РЗ
2.2. Приготовление образца
2.3. Спектроскопия ЯМР .
2.4. Расчет пространственной структуры
2.5. МДрелаксация
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Экспериментальные данные для расчета структуры ТМ ВЫ1РЗ
3.2. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР
3.3. Элементы вторичной структуры.
3.4. Расчет пространственной структуры
3.5. Минимизация конформационной энергии экспериментальной структуры
3.6. Димеризационный ИНТЕРФЕЙС ВМРЗ ТМ
3.7. Взаимодействие ВМРЗ ТМ с водой.
3.8. Связь структурнодинамических свойств ВТИРЗ ТМ и проапоптозной функции белка
3.9. Заключение.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Объектом исследования данной диссертационной работы является трансмембранный домен человеческого белка I3. Этот белок относится к группе проапоптозных белков ВНЗI семейства 2 на основании анализа его первичной структуры. Однако, I3 и его ближайшие гомологи обладают рядом уникальных особенностей. Хотя, как и другие ВНЗ белки они обладают узкой специфичностью к условиям, вызывающим их экспрессию и активацию, механизм их действия отличается от других представителей 2. Клеточная смерть, вызванная I3, происходит без участия каспаз и имеет несколько признаков некроза. Как и многие другие проапоптозные белки I3 может образовывать гетеродимер с антиапоптозными представителями семейства 2. В работе 5 было показано, что посредством трансмембранного домена I3 может образовывать стабильный гомодимер как в мицеллах , так и в мембранах . i. Поэтому I3 ТМ представляет особый интерес с точки зрения исследования механизма взаимодействия трансмембранных аспиралей. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые. На сегодняшний день опубликована только одна пространственная структура высокого разрешения димера трансмембранных аспиралей трансмембранный домен белка гликофорин А, , 6. В представленной диссертационной работе методом гетероядерной спектроскопии ЯМР исследован трансмембранный домен белка I3 в комплексе с липидной бицеллой. Показано, трансмембранные аспирали I3 пересекаются под углом правая закрутка и образуют параллельный симметричный димер. Разработана методика МДрелаксации полученных методом спектроскопии ЯМР пространственных структур трансмембранных сегментов. Она позволяет обойти ряд экспериментальных ограничений, накладываемых мембранной природой объекта исследования. Методом МД рассчитывается молекулярнодинамическая траектория для полученной экспериментально ЯМРструктуры трансмембранного домена, которая помещается в явно заданный липидный бислой, при этом на протяжении всего расчета на протоны белка накладываются экспериментальные пространственные ограничения. Такой комплексный подход позволяет достоверно описать пространственную структуру и внутреннюю динамику трансмембранных белков в липидном окружении. ВЫ1РЗ ТМ в качестве ионного протонного канала в механизме проапоптозной активности белка. Работа выполнена в группе ЯМР лаборатории структурной биологии института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. Часть I. Митохондрии одни из важнейших органелл, они отвечают за энергетический метаболизм клетки и гомеостазис Са2 7, поэтому неудивительно, что нарушение функционирования митохондрий приводит к клеточной смерти, изза недостатка АТФ и дисбаланса Са2 8. Однако, даже нормально функционирующая митохондрия может стать причиной гибели клетки, так как является одной из ключевых фигур в процессе апоптоза. В многоклеточных организмах митохондрии получают апоптотический сигнал и запускают ряд процессов, которые могут, как вызывать, так и ингибировать смерь клетки. Под действием некоторых факторов например, радиации возможно прекращение транспорта электронов через мембрану митохондрии, что в свою очередь приводит к снижению производства АТФ. Апоптоз является энергоемким процессом, и энергетический коллапс наблюдается в основном на поздних его стадиях. Другим последствием нарушения транспорта электронов является возрастание производства активных форм кислорода АФК. Основная же роль митохондрии в процессе апоптоза связана с высвобождением из межмембранного матрикса растворимых белков, активаторов каспаз например, цитохром С, I i ii , прокоспазы 2, 3, 9 и I. Регуляторами этого процесса являются белки семейства 2 9, например белок Вс12 находится во внешней мембране митохондрии и препятствует выходу цитохрома С. Цитохром С белок, участвующий в цепи переноса электронов через мембрану митохондрии, он также является наиболее изученным активатором каспаз.