Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов

• Автор: Трофимова, Ольга Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 156 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Современные представления о липолитических ферментах

1.1. Характеристика продуцентов и физикохимические свойства липаз

1.2. Особенности структуры и механизма действия эстераз

1.3. Значение липолитических ферментов в природе и хозяйственной деятельности человека

ГЛАВА 2. Современные аспекты иммобилизации липолитических ферментов

2.1. Методы иммобилизации липаз

2.2. Физикохимические аспекты катализа иммобилизованными ферментами

2.3. Применение иммобилизованных липаз в промышленности, медицине, аналитических целях

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования
3.1. Объект исследования
3.2. Методы исследования
3.2.1. Выделение препарата липазы из микромицета Шгориз аропсиБ
3.2.2. Очистка и определение молекулярной массы липазы методом гельхроматографии
3.2.3. Ионообменная хроматография на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой ДЭАЭцеллюлозой
3.2.4. Определение содержания белка в препарате методом Лоури
3.2.5. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментых препаратах модифицированным методом Лоури
3.2.6. Спектрофотометрический метод определения каталитической активности липазы
3.2.7. Подготовка ионитов АВ и АВ2П к иммобилизации
3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации липазы
3.2.9. Методика ковалентной иммобилизации липазы с помощью глутарового альдегида
3.2 Подготовка исследуемых образцов к анализу методом ИКспектрофотометрии ИКС
3.2. Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном геле
3.2 Метод визуализации пространственной структуры белковых молекул на базе программы i
3.2 Фотоокисление белков в присутствии метиленового голубого
3.2 Статистическая обработка результатов экспериментов
ГЛАВА 4. Выделение, очистка, физикохимические свойства препарата
липазы из i i
4.1. Изучение условий выделения и очистки липазы из i i
4.2. Физикохимические свойства липазы из i i
ГЛАВА 5. Исследование особенностей строения активного центра липазы i i
5.1. Идентификация имидазольной группы гистидина в каталитическом центре молекулы липазы i i
5.2. Воздействие фенилметилсульфонилфторида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы
5.3. Воздействие дициклогексилкарбодииимида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы
5.4. Исследование роли ионов двухвалентных металлов в функционировании липазы i i
ГЛАВА 6. Изучение особенностей четвертичной структуры липазы Юигорарошсдо
6.1. Воздействие додецилсульфоната натрия на состояние четвертичной структуры липазы
6.2. Исследование особенностей вторичной структуры субъединиц липазы методом ИКспектрофотометрии
6.3. Модификация липазы бифункциональными реагентами
6.4. Визуализация олигомерной структуры липазы Шигорш i методом атомносиловой микроскопии
Глава 7. Ковалентная иммобилизация липазы из Шпгорш аротсиз на анионите АВ2П модифицированным глутаральдегидным методом
7.1. Исследование условий иммобилизации липазы на некоторых ионообменных смолах
7.2. Некоторые физикохимические и кинетикотермодинамические аспекты катализа свободной и иммобилизованной липазой
7.3. Исследование технологических характеристик реакции гидролиза триглицеридов липазой, иммобилизованной на анионите АВ2П
ГЛАВА 8. О молекулярном механизме реакции ферментативного гидролиза триглицеридов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Показано, что липазы микроорганизмов отличаются более высокой активностью и богатым разнообразием свойств по сравнению с ферментами растительного и животного происхождения. Большинство липаз, синтезируемых микроорганизмами, имеют оптимальные температуры функционирования вС. Многие из этих ферментов обладают устойчивостью к крайним значениям концентраций ионов водорода, некоторые высокой термостабильностью. Ряд исследователей показывают, что термостабильность фермента находится в тесной связи с особенностями строения белковой молекулы количеством водородных связей, стабилизирующих ее структуру, содержанием основных и неполярных аминокислотных остатков, гидрофобностью молекулы, наличием или отсутствием цистеина Л. Г. Логинова, Л. А. Егорова, . Известными продуцентами термоустойчивых липаз являются термофильные виды бактерий из родов i, i, и др. Например, термоалкалофильная липаза i i расщепляет триглицериды при высоких значениях температуры и . Фермент обнаруживает значительную степень гомологии аминокислотных последовательностей с липазами стафилококков и содержит дополнительный центр связывания цинка. Оптимальная температура липолиза объясняется большой длиной спираликрышки в закрытой конформации фермента, открывание которой триггерный процесс, обусловленный термической диссоциацией гидрофобных взаимодействий. Фермент сохранял 0 гидролитической активности после инкубации в течение ч при С. Термостабильность липазы изучена методом дифференциальной сканирующей калориметрии К. Авторы осуществили предварительную замену гидрофобных остатков триптофана в молекуле фермента на гидрофильные. Выделение липолитических ферментов из термофильных микроскопических грибов приобретает особенную значимость в связи с актуальностью использования липаз в промышленной технологии и медицине. Следовательно, поиск термоустойчивых штаммов микромицетов является одной из важных задач химической энзимологии. Способностью к синтезу термоустойчивых липаз обладают микромицеты родов i, i, и др. Термостабильная липаза обнаружена впервые в отрубях риса iv. Очищенный гликопротеин с молекулярной массой 9,4 кДа характеризовался оптимальным значением температуры гидролиза С и не утрачивал каталитическую активность при С, показывая практически полную сохранность всех элементов вторичной структуры . М. . С, причем мутантная термостабильная липаза характеризовалась следующими заменами в первичной структуре Рго на i, А1а на , 8 на V. Данный эффект авторы объясняют значительными перестройками в трехмерной структуре дикого типа. При изучении особенностей воздействия на функционирование липаз ингибирующих веществ установлено, что присутствие ионов 3, 2, 2, снижает скорость липолиза . Конкурентный тип ингибирования указывает на присутствие остатка серина в активном центре фермента. Г.Б. Ксандопуло и др. Большое внимание исследователей уделяется влиянию поверхностноактивных веществ на активность липаз и выяснению механизма их действия. Наиболее исследованными в этом отношении являются соли желчных кислот. Ряд авторов С. Действие холатов объясняется ускорением диффузии длинноцепочечных жирных кислот с границы раздела фаз, предотвращающей ингибирование продуктами липолиза. Однако липаза из i i ингибировалась холатом натрия, а липаза из iii i дезоксихолатом К. Д. Давранов, . Авторы считают, что снижение скорости липолиза на стадиях гидролиза моноглицеридов может быть связано с образованием мицелл холатов с моноглицеридом и жирной кислотой, препятствующих доступу фермента к субстрату. X. . При кристаллографическом исследовании данной липазы идентифицированы два центра связывания холатов первый центр расположен вблизи каталитической триады, в петлеобразной структуре, второй в некотором отдалении. При связывании с таурохолатом петлеобразная структура теряет мобильность, приобретая энергетически выгодную для катализа конформацию. Активаторами липолитических ферментов являются ионы Са2, , 2 . При этом ионы 2 могут как входить в состав структуры Сазависимых ферментов, так и служить косвенными активаторами, предотвращая ингибирование липолиза конечными продуктами жирными кислотами.