Нерепликативная гомологичная рекомбинация между фрагментами РНК полиовируса

• Автор: Коршенко, Сергей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Обшис сведения о полновирусс.

2.2. Модели генетической рекомбинации.

2.3. Доказательства существования репликативной рекомбинации между молекулами РНК.

2.4. Возможные механизмы репликативной рекомбинации.

2.5. Возможные механизмы расщепления и лигирования молекул РНК

2.6. Доказательства существования нереиликативной рекомбинации между молеку лами РНК

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Ферменты н реактивы
3.2. Плазмида.
3.3. Бактериальный штамм
3.4. Синтетические олигонуклеотиды
3.5. Базовые методы молекулярного клонирования
3.6. Получение илазмндных конструкций, содержащих кДНК фрагментов
3.7. Получение полноразмерных транскрингов
3.8. Модификации концевых нуклеотидов транскрингов
3.9. Анализ вирусных клонов .
3 Определение нуклеотидной последовательности КТ РСКфрагмептон
и плазмидной ДНК
3 Моделирование вторичной структуры РНК.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Конструирование 5 и Зфрагмеитов РНК полионируса, точно дополняющих друг друга.
4.2. Образование рекомбинантов между 5 и Зфрагмснтами РНК полиовируса, точно дополняющими друг друга.
4.3. Конструирование 5 и Зфрагментов РНК полиовируса, имеющих облаегь перекрывания.
4.4. Образование рекомбинантов между 5 и Зфрагментамн РНК нолиовируса, имеющих область перекрывания
4.5. Отклонение от точности при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК нолиовируса
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1. Доказательство существовании неренликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса
5.2. Лигирование фрагментов РНК полиовируса.
5.3. Рекомбинации между перекрывающимися фрагментами РНК полиовируса.
5.4. Точность при образовании рекомбинантов меж, фрагментами РНК полиовируса.
5.5. Репликативная и нсрспликативнаи рекомбинации у РПКсодержащих вирусов.
5.6. Биологическая значимость нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Согласно перепликативной модели рекомбинация происходит не в процессе синтеза повой цепи, а в результате разрыва и воссоединения предварительно синтезированных молекул РНК. Поскольку представленные свидетельства в пользу перепликативной рекомбинации между молекулами РНК имеют уязвимые места СЬсКспп с1 а РНК неренликативио рекомбинировать между собой является важной задачей. Данная работа посвящена исследованию перепликативной рекомбинации между молекулами РНК вируса полиомиелита. Первое свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено Д. В. Четвсрипым с соавторами в бесклеточной системе репликации фага 01 СЬеНепп с1 а1. В системе использовались рсплнказа, гЬ1ТР и неспособные к экспоненциальной репликации перекрывающиеся фрагменты одной из сателлитных РНК. ЗОН группы у 5фрагмента. На основании полученных результатов авторы предположили, что рекомбинация идет по нсрспликативному механизму, напоминающему вторую стадию вырезания самосплайсирующихся нитронов. Второе свидетельство в пользу нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК было получено в нашей лаборатории в системе i viv вируса полиомиелита . В системе использовались неспособные к репликации и трансляции перекрывающиеся фрагменты вирусной РНК. При совместной трансфекции восприимчивой к полновнрусу культуры клеток такими фрагментами образовывалось жизнеспособное вирусное потомство. Было показано, что вирусные геномы являются рекомбинантами между 5 и Зфрагмснтами. Часть рекомбинантов включала целый 5фрагмент. Такие рекомбинанты образовывались только в том случае, если 5фрагмент содержал 3концевой фосфат. На основании полученных результатов и в связи с тем, что образование вирусной РНКполимеразы до акта рекомбинации было блокировано, авторы сделали вывод, что рекомбинация идет по нсрспликативному механизму. Однако, принимая во внимание, что в первом случае рекомбинация, видимо, зависит от присутствия вирусной РНКполимсразы, а во втором этот фермент мог образоваться хотя и маловероятно в результате трансляции одного из фрагментов, полностью исключить возможность образования рекомбинантов репликативным путем было нельзя. Поэтому мы поставили перед собой цель неоспоримо доказать, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может происходить без участия РНКнолнмеразы, и, если это будет выполнено, то определить необходимые условия этого процесса. РНК в зависимости от химической структуры концевых нуклеотидов. В ходе выполнения настоящей работы были сконструированы четыре пары неинфскционнмх 5 и 3фрагмснтов РНК полиовируса. Любая пара фрагментов представляла собой взаимодополняющие части вирусного генома, разорванного в участке, кодирующем вирусную РИКполимеразу. При этом фрагментам трех пар не хватало только одной фосфоднофирной связи для образования целого генома, а фрагменты четвертой пары содержали перекрывающиеся гомологичные последовательности. Было показано, что при совместной трансфекции восприимчивой к иолиовнрусу культуры клеток исинфекционными 5 и 3фрагментамн полновнрусной РНК образовывалось жизнеспособное вирусное потомство, которое было представлено рекомбинантами между этими фрагментами. Поскольку образование вирусной РНКполнмсразы до акта рекомбинации было невозможно, полученные данные неоспоримо свидетельствуют в пользу того, что рекомбинация между молекулами РНК полиовируса может идти по нсрспликатнвному пути. Впервые было продемонстрировано существование гомологичной нереплнкативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса. Было показано, что 5 и 3фрагменты могут объединяться путем 1 лигирования конецвконсц, 2 и 3 взаимодействия между 3 или 5концевыми нуклеотидами одной молекулы и внутренним нуклеотидом другой молекулы и 4 взаимодействия между внутренними нуклеотидами двух молекул. РНК активировалась присутствием Зфосфата и 5ОН группы, соответственно. Существование нерепликативной рекомбинации РНК предоставляет дополнительную возможность для объяснения эволюции вирусных и, возможно, клеточных геномов.