Исследование слияния вируса гриппа с бислойными липидными мембранами

• Автор: Максаев, Григорий Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил

Содержание
Введение

Слияние в модельных системах теоретические основы

Вирус фИИГО и его строение

Липидный состав мембраны вируса

Слияние

Гемагглютинии

М2бсжж
М1 белок

Различные модельные системы.

Слияние вирус с эритроцитом и

Слияние вируса с диносомами и плоскими БЛМ
Слияние клеток, экспрессирующих вирусные Б С,
с биологическими и искусственными мембранами
Кардиотоксии СГП
Апоотозные белки 3
Постановка задач
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
РатеЬс1атр и метод измерения адмитгансо клеточной мембраны н БЛМ
Измерения адмиттанса мембран
Флуоресцентная видсомикроскопия
Флуоресцентная спектроскопия
Выделение, очистка и окраска вирусов гриппа А
Клеточные линии
Протсолигичсская обработка экспрессирующих Г А клеток
Обработка клеток, липосом и БЛМ .сгги1еами
Аппликация кислого
Флуоресцентные зонды
Приготовление липосом малого размера
Регистрация пярусного генома
Эксперименты в среде с высокой вязкостью
Липосомы с различными значениями и буферной мкости внутренней среды
Слияние липосом с вирусом штамма А.АюЬбЗ
Различные липидные состоим липосом
Кардиотоксии СТО
Алогпоакые пептиды
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Слияние пи руса гриппа с БЛМ.
Метод измерения адмигтанса мембранного пэтчп
Слияние клеток НАЪ2, экспрессирующих ГА, с лкпосомами
Слияние вирусных частиц с эритроцитами и гигантскими липосомами
Слияние вируса с БЛМ
Слияние вируса с малыми фрагментами БЛМ
Блокирование изменений проводимости
Слияние вируса гриппа А различных штаммов с БЛМ
Выяснение происхождения скачков электрической проводимости в системе внрусБЛМ Слияние вируса гриппа с липосомами чалого размера.
Липидный краситель
Водорастворим ъье крае пси и
Эксперименты в среде с высокой вязкость
Различный липидный состап мембран липосом
Слияние липосом с вирусом шгамма АА1сЫ2
Липосомы с различными значениями и буферной емкости внутренней среды
РНКспсцифичныс красителя
Кардиотоксин СТО
Аполтшкые белки
Заключение
Благодарности
Выводы
Список литературы


Она представляет собой живую клетку фибробласт, которая способна экспрессировать в своей цитоплазматической мембране вирусный ГЛ. Так как ген, кодирующий ГА вводится в клетку с помощью плазмиды, имеется возможность получить мутантные клетки, экспрессирующие ГА различных типов. Примером может служить клетка ЗТЗ НАЬ2, экспрессирующая гемагглютанин вируса гриппа А. Такая клетка имеет размер около Юмкм и хорошо видна в световой микроскоп. Она может сливаться как с искусственными бислоями БЛМ, линосомами, так и с другими клетками такими как эритроциты. С помощью ставших обычными методов электрофизиологии пэтчкламп возможно регистрировать образование и динамику роста отдельной норы слияния между клеткой НАЬ2 и мембраноймишенью. Кроме того, элскгрофизиологичсскнс измерения можно дополтпъ данными по кинетике липидного обмена в процессе слияния, а также исследованиями перераспределения водорастворимых флуорофоров. Вместе с тем 3i модель вируса гриппа обладает рядом существенных недостатков. Вопервых, плотность экспрессии вирусного белка на клеточной мембране существенно ниже, чем в вирусе. Вовторых, липидный состав клеточной и вирусной мембран совершенно различньг. И втрстьих, как в клеточной, так и в вирусной мембранах присутствуют различные белки, которые могут различным образом взаимодействовать с ГА. Кроме того, в клетке отсутствует жесткий белковый каркас, формируемый в вирусе гриппа специальным белком и контакт ирующий непосредственно с внутренним монослосм вирусной мембраны. Поэтому для более полного понимания процессов, происходящих при вирусном слиянии, необходимо обратиться к слиянию отдельного вириона. Слияние в модельных системах теоретические основы. Наиболее простой моделью, на которой исследовалось слияния мембран, была система двух синтетических БЛМ 6. Для не было показано, что при достаточном сближении двух бислов под действием перепада гидростатического давления происходит их слияние, которое представляет собой многоступенчатый процесс. Рис. Образование свалка и триламинарной структуры. Прежде всего, после некоторого времени ожидания формируется т. Тем самым возникает липидная непрерывность. Затем сталк расширяется в радиальном направлении, образуя гибридный контактный бислой так называемую триламикарную стрктуру ТС. После этого контактный бислой разрушается, оставляя вместо себя пору слияния, которая, расширяясь, формирует так называемую мембранную трубку. Было обнаружено, что время ожидания монослоЙного слияния зависит от природы липидов, а именно от их молекулярной геометрии или, на макроскопическом языке, от спонтанной кривизны монослосв 3. Под спонтанной кривизной, понимают кривизну бнелоя в наиболее стабильной фазе, характерной для бислоя данного состава в полностью гидратированном состоянии принято, что кривизна монослоя мицеллярной структуры положительна, а монослоя, образующего инвертированную гексагональную Нц фазу отрицательна. Рис. Типы липидных молекул. ФХ близкая к нулю спонтанная кривизна, и он образует ламеллярные структуры цилиндр рис. В случае же обратного распределения липидов слияние ингибируется. Важно подчеркнуть, что эта закономерность характерна и для биологического слияния1. На основе этих закономерностей была предложена модель слияния липидных бислов, в которой важнейшей стадией является стадия полуслияния и образования ТС. Расчеты энергии промежуточных состояний согласно разработанной Маркиным н Козловым количественной теории слияния 4, 5, основаны на механике мембран 6. При этом теория предполагала, что энергия сталка сводятся к упругой энергии изгибе дсмонослоя. К, и КР две главные кривизны нетральной поверхности мембраны, не меняющей площади при нагибе, О, модуль изгиба, К5 спонтанная кривизна мембраны в ненапряженном состоянии. Вклад ы энергию системы от трансмонослобв в теории не учитывался. Рис. Изображение гипотетической структуры полусталха. К, положительная экваториальная кривизна, К меридиоиаль кая кривизна. Из рис. Имеют и виду данные, полученные при жюшптое и вирусном слиянии.