Кинетика биолюминесцентной реакции в нетрадиционных средах

• Автор: Суковатая, Ирина Егоровна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и каталитические свойства бактериальных люцифераз ii и У.Иагуеуч

1.2. Ферментативный катализ в водноорганических средах

1.2.1. Роль различных взаимодействий в поддержании нативной конформации белков

1.2.2. Классификация органических растворителей

1.2.3. Эффекты воздействия среды на конформацию различных белков.

1.2.4. Роль воды в ферментативном катализе, проводимом в водноорганических средах.

1.2.5. Влияние микроокружения на каталитические свойства ферментов

1.2.6. Модели действия органических растворителей на белковые макромолекулы.

и. Постановка тадач исследования
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Влияние органических растворителей иа кинетические параметры реакций, катализируемых люкнферазамн из Р.ШщпШМ и У.каггеуч
3.1.1. Интенсивность свечения люцифераз в водноорганических средах
3.1.2. Влияние органических растворителей на константу спада биолюминесценции бактериальных люцифераз
3.1.3. Изменение квантового выхода биолюминесцентной реакции в водноорганических средах
3.2. Кинетический анализ взаимодействия люцифераз с субстратами в водноорганических средах
3.2.1. Определение типов взаимодействия органических растворителей с люциферазами по отношению к РММН2 и альдегидам с разной длиной цепи.
3.2.2. Константа Михаэлиса и природа взаимодействия субстратов и люцифераз в водноорганичсских средах
3.2.3. Влияние изменения диэлектрической проницаемости реакционной среды на кинетику бактериальных люцифераз
3.3. Обсуждение результатов.
ЛИТЕРАТУРА


Г идрофобные остатки упакованы внутри полости в обеих субъединицах. Сквозь внутренние поверхности димера проходят различные внутрисубъединичные связи. Большинство таких контактов наблюдается в параллельном 4х спиральном бочонке. В основном, это ВаидерВаальсовые взаимодействия. Интересная водородная связь наблюдается между i. . Эти остатки есть в а и р субъединицах всех бактериальных люцифераз. Мугация i в асубъедннице V. Другая водородная связь наблюдается между . . А1а. А1а. Стены этой маленькой полости включают i. . Му гация i. А1а или приводит к инактивации фермента. Предполагается, что в связывании одного из субстратов люциферазы участвуют следующие аминокислотные остатки связывает фосфатную часть , Тгр4 и Тгр0 связывают изоаллоксазиновое кольцо. Также большое значение в связывании флавнна имеет . Тем не менее, однозначного представления о связывании фермента и флавина в настоящее время нет . Однако в рассматриваемых доменах гидрофобии меньше половины аминокислот. Следовательно, эти участки имеют сложную конформацию, из них невозможно построить аспираль или 5структуру так, чтобы получилась длинная гидрофобная щель . Известно, что модификация вторичных ОИгрупп рнбитила, не оказывает влияния на связывание флавина и меняет характер связывания альдегида. Повидимому, сайты связывания альдегида и рибитила расположены рядом. Как показывает конформационный анализ, рибитил в белках предпочитает вытянутую структуру, как и альдегид, что позволяет им контактировать друг с другом на протяжении 45 атомов углеродной цепи. Модификация альдегида вблизи СНОгруппы лишает его способности вступать в реакцию с люциферазой. Если учесть, что изоаллоксазиновое кольцо флавина спрятано в гидрофобный карман, то и альдегидная головка должна обладать значительной гибкостью, чтобы в этот карман попасть. Поэтому введение двойной связи между атомами С2 и С3, делающее этот участок жестким, не способствует биолюминесценции. Представляется наиболее вероятным, что СНОгрупгга располагается над атомами Сю, 1, и С2. Геометрия группы и распределение зарядов вполне допускают указанное расположение атомов . Однако, вышеописанное представление о взаимодействии флавина и альдегида в настоящее время подвергается сомнению. Существует множество работ, в которых представлена схема люминесцентной реакции, где альдегидная головка реагирует с С4аатомом изоаллоксазинового кольца гидропероксифлавина . Индивидуальные субъединицы люцифераз неактивны, но могут рекомбинировать до активной люциферазы . Присутствие металла в молекуле люциферазы, простетических групп, неаминокислотных остатков не показано . Бактериальная люцифераза содержит БНгрупп. На асубъединице люциферазы У. Иапгеу сугцесгвует высокоактивная БНгругггга. Насыщающие концентрации РМЫ полностью защищают люциферазу от инактивации иодоцетамидом. Это позволяет предположить, что реактивный сульфгидрил расположен в активном центре либо в непосредственной близости от него на асубъединице в триптическом пептиде с последовательностью аминокислот рЬе Пепвагд. Однако, непосредственное участие реактивного сульфгидрила в каталитической функции не показано. Люцифераза У. Иатеуч имеет специфический связывающий сайт для фосфата, который связан с флавинсвязывающим сайтом. Скорость оборота фермента сильно зависит от концентрации фосфата. Что касается сродства люциферазы к флавину, то не возникает сомнений, что наибольшим сродством люцифераза обладает к восстановленному РММ. Однако работами некоторых авторов показано, что молекула люциферазы имеет также и сайт связывания для окисленной формы флавина . Альдегид присоединяется вдоль всей алкильной цепи, и наиболее сильное взаимодействие заякорнвание наблюдается при альдегидной группе 6. Рюгуеу подвержена меньшему альдегидному ингибированию по сравнению с диким типом. Следовательно, молекулярный механизм альдегидного ингибирования включает суя в позиции 6 . Кинетические параметры реакции, каталишруемых тоциферишми Р. ШоцпаШ и У.