Липидный бислой и небислойные структуры в организации и функционировании биологических мембран

• Автор: Тараховский, Юрий Семенович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 203 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. Многообразие структурных форм, образуемых липидами

1.1 Фазовые переходы бислойных структур

1.2. Полиморфные фазовые переходы бислой небислойные структуры

1.3. Свойства липидов, определяющие формирование бислойных или небислойных структур

1.4. Механизм трансформации бислоя в небислойные структуры

2. Влияние различных веществ на полиморфизм липидов

2.1. Биоактивные липиды

2.2. Модуляция полиморфизма липидов полипептидами и белками

2.2.1. Взаимодействие полипептидов с бислоем

2.2.2. Полиморфные фазовые переходы липидов в присутствии полипептидов и белков

3. Полиморфизм липидов i viv
3.1. Небислойные структуры липидов в цитоплазме
3.2. Участие липидов в транслокации молекул через мембраны
3.3. Роль полиморфизма липидов в процессах слияния мембран
3.3.1. Интермедиаты слияния
3.3.2. Участие небислойных структур в процессах слияния мембран
4. Полиморфизм липидов в генной терапии
4.1. Задачи и методы генной терапии
4.2. Методы доставки генетического материала
4.3.1. Вирусы в качестве средств доставки генетического материала
4.5.2. Искусственные транспортные средства
4.6.3. Катионные липиды
4.7. Структура ДНКлипидных комплексов
4.8. Механизмы липофекции
4.8.1. Доставка ДНКлипидного комплекса к поверхности клеток.
4.8.2. Взаимодействие комплекса с клеточной поверхностью и проникновение в эндосомы.
4.8.3. Освобождение ДНК в цитоплазму
4.8.4. Транспорт ДНК в ядро
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Методы исследования
1. Приготовление липосом
2. Протеолипидные комплексы
3. Приготовление препаратов ДНК
4. ДНКлипидные комплексы
5. Определение трансфекционной активности ДНКлипидных комплексов
6. Бактерии
7. Инфицирование клеток бактериофагами
8. Определение выхода калия из цитоплазмы клеток ii i
9. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия
. РЯМР спектроскопия
. Рентгеновская дифракция
. Электронная микроскопия
а. Метод замораживанияскалывания
б. Метод ультратонких срезов
в. Метод негативного окрашивания
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Исследование модельных систем
1.1. Электростатические силы в регуляции полиморфного поведения липидов
1.1.1. Формирование инвертированной гексагональной НП фазы в эквимолярных смесях катионных и анионных липидов
1.1.2. Кубические фазы образуются в образцах, содержащих двойной избыток анионного или
катионного липидов
1 Большой дисбаланс зарядов приводит к исчезновению кубической фазы и появлению губчатой структуры
1.1.4. Чистые катионные и анионные липиды образуют ламеллярную фазу
1.1.5. Обшие закономерности в поведении смесей анионных и катионных липидов
1.2. Полиморфизм галактолипидов, инициируемый хлорофиллом
1.3. Фазовые переходы в белоклипидных комплексах
1.3.1. Роль перекисного окисления в белоклипидных взаимодействиях
1.3.2. Латеральная сегрегация белка в мембране при формировании двумерных кристаллов
1.4. Фазовые переходы в ДНКлипидных комплексах
1.4.1. Комплекс ДНКСа2ЭРРС
1.4.2. Комплекс ДНК Са2лецитин
1.5. Стабилизация ДНК в комплексах с катионными липидами
1.5.1. Ультрафиолетовая спектроскопия ДНКлипидных комплексов после теплового воздействия
1.5.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия ДНКлипидных комплексов посте тепловой
обработки
1 Анализ нативных ДНКлипидных комплексов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии
1.5.4. Разделение и анализ термостабильного и термолабилъного комплексов
1.5.5. Структурные основы термостабильности ДНК
2. Полиморфизм липидов в клетке
2.1. Фазовые переходы в мембранах грамотрицательных бактерий
2.1.1. Динамика структурных преобразований мембран ii i в средах с высоким осмотическим давлением
2.1.1. Полиморфное поведение мембран грамотрицателыгых бактерий в присутствии двухвалентных катионов
2.2. Транслокация ДНК через мембраны при инфицировании клеток ii i фагом Т4
.1. Электронномикроскопический анализ взаимодействия фага с клеткой
2 Температурная зависимость процессов инфицирования
.3. Инфицирование деэнергизованных клеток
2.2.4. Последовательные стадии структурных изменений в системе бактериофагбактсриальная клетка в
процессе инфицирования
.5. Слияние мембран при лизисе клеток ii i, индуцированном фагом Т
2.3. Взаимодействие катионных липосом с мембраной эритроцитов
2.3.1. Способность липосом к полиморфным превращениям
2 Адсорбция липосом на поверхности эритроцитов
2.3. Процессы эндошггоза и экзоцигтоза липосом
2.3.4. Возможное значение и механизмы наблюдаемых структурных изменений
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Биконтинуальные фазы изображены в виде набора из нескольких элементарных ячеек соответствующей бесконечной периодической минимальной поверхности, созданной компьютером . С решетка гиройд, повсрхность, группа I3, аспект . РтЗп, аспект 3 Е группа 3, аспект . Расчет основывался на следующих формулахиггай V. Рповерхносгь iiiv, группа, I3, аспект 9, иногда называют кошмар сантехника i, хота ее структура является наиболее простой. Элементарная ячейка содержит три взаимно перпендикулярные водных канала, которые соединяются со смежными ячейками, образуя кубическую решетку. Очевидно, что, на самом деле, имеется две идентичных сети водных каналов, которые отделены бислоем липида. РпЗт, аспект 4, называемая дьявольским наслаждением vi i, разделяет две идентичные и не связанные друг с другом сети водных каналов, образующих решетку алмаза. В каждом узле такой решетки встречаются четыре канала, под углом 9,5, характерных для тетраэдра. Джери i , и является наиболее сложной из известных в настоящее время и трудных в изображении структур периодических минимальных поверхностей. В ней отсутствуют оси зеркальной симметрии, имевшиеся в предыдущих структурах, и она отделяет две сети водных каналов, образующих правую и левую спирали. Несмотря на очевидные различия структуры, все три типа кубической фазы способны трансформироваться друг в друга в последовательности довольно часто сосуществуют в одном образце , i С, . Взаимные превращения из одной фазы в другую может быть связано с различиями спонтанной кривизны бислоя этих фаз, а движущей силой перехода может служить степень гидратации образца и, соответственно, соотношение объемов гидротационной воды и масла, влияющих на кривизну границы раздела фаз. К настоящему времени обнаружено также четыре вида мицеллярных кубических фаз. На представленном рисунке показаны два примера наиболее хорошо изученных и сложных мицеллярных фаз. Фаза 3 образована мицеллами типа I, внутри которых находится гидрофобное ядро масло в воде. Элементарная ячейка содержит 8 мицелл, причем 6 мицелл ориентируются параллельно граням куба и пересекают грани по середине Л, 0, О,у, x. V кроме того, 2 мицеллы располагаются в углах куба, в позициях с симметрией 3 V . Фаза О7 образована инвертированными мицеллами тип II. В центре мицелл находится вода вода в масле. Элементарная ячейка содержит мицеллы, положение которых позволяет разделить их на 2 группы, отличающихся по типу симметрии i V. Существует два теоретических подхода в объяснении молекулярных основ фазового поведения липидов, определяющего формирование бислойных и различных небислойных структур. Один подход основан на оценке усредненной вероятностной формы липидных молекул Ivii , vii и др. Оба подхода взаимно дополняют друг друга. Ваальса, наличие водородных связей и заряженных групп при определении стерических параметров взаимодействия между молекулами. На основе этих параметров определяется площадь поперечного сечения полярных голов а0, критическая длина 1с и объем углеводородных цепочек v. Далее предполагается, что эти геометрические свойства липидных молекул определяют так называемые параметры упаковки Р на основании которых можно делать предсказания о предпочтительной форме молекулы липида. Было экспериментально показано, что липиды с Р0,5 образовывали мицеллы, т. При величине 0,5Р1,0 формировались ламеллярные структуры, т. И, наконец, при Р1 образовывались инвертированные фазы липидов, что соответствовало форме молекул в виде инвертированного конуса Рис. Несмотря на простоту, эта модель оказалась очень удобной при объяснении поведения разнообразных липидных систем, хотя она не обладает большой предсказательной силой. Критики этого подхода указывают на то, что при температуре выше точки главного фазового перехода молекулы липидов не имеют определенной формы, и их поведение не может описываться простыми параметрами упаковки , . Альтернативный подход в описании фазовых переходов бислойнебислойные структуры основан на анализе баланса между величинами свободных энергий упаковки и изгиба монослоев и др. При этом учитываются силы, возникающие из взаимодействий, как в полярных, так и в гидрофобных областях мембраны.