Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах

• Автор: Коновалова, Елизавета Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярногенетические онкомаркеры и методы их определения.

1.2. Иммуиохимичсские опухолевые маркеры и методы их определения

1. 3. Простата специфический антиген.

1.4. Белковые микрочипы

1.4.1 Двумерные белковые микрочипы для анализа онкомаркеров

1.4.2 Белковые микрочипы на основе гидрогелей

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Белковые микрочипы
2. 1.2. Регистрация сигналов с гелевых ячеек микрочипа.
2. 1.3. Подбор условий иммобилизации белков
2.1.4 Выбор состава геля на примере прямого анализа ГСА.
2.1.5. Сравнение двумерных и трехмерных микрочипов.
2.1.6. Определение копстанг ассоциации Ка5 бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами.
2.2. Белковый гидрогслсвый микрочип для количественного
анализа двух форм ПСА
2.2.1. Характеристики количественного иммуноанализа ПСА на биочипах
2.2.2. Внутренняя калибровочная кривая.
2.2.3. Определение значений эффективных концентраций
для внутренней калибровочной кривой
2.2.4. Получение результатов иммуноанализа.
2.2.5. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови.
2.2.6. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСЛ
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Приборы и реактивЕЛ
3.2. Изготовление белковых микрочипов.
3.3. Окрашивание белков флуоресцентным красителем Су5.
3.4. Флуоресцентные и хсмшиомииесцентные измерения
3.5. Определение степени иммобилизации белков в геле
3.6. Определение ферментативной активности белков в растворе
3.7. Регистрация ферментативной активности белков па микрочипс
3.8. Определение процента сохранения ферментативной активности
пероксидазы после иммобилизации на чипе.
3.9. Прямой анализ пероксидазы на микрочипе с иммобилизованными антителами
3.9.1 Соидвичиммуноанапиз ПСА
3.9.2. Кинетические измерения на микрочипах.
ЗЛО. Определение констант ассоциации бинарного комплекса
флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе
моноклональными антителами
3 ТвердофазнЕлй иммуиоферментиый анализ I
на луиочиом планшете.
БЛАГОЛАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ГЛАВА 1. Молекулярногенетические онкомаркеры и методы их определения. Простата специфический антиген. ГЛАВА 2. Регистрация сигналов с гелевых ячеек микрочипа. Выбор состава геля на примере прямого анализа ГСА. Сравнение двумерных и трехмерных микрочипов. Определение копстанг ассоциации Ка5 бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами. Внутренняя калибровочная кривая. Получение результатов иммуноанализа. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови. ГЛАВА 3. Изготовление белковых микрочипов. Окрашивание белков флуоресцентным красителем Су5. Кинетические измерения на микрочипах. ЗЛО. БЛАГОЛАРНОСТИ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. фосфатносолевой буфер, содержащий 0. Злокачественные опухоли являются одними из самых распространенных заболеваний с летальным исходом. Рак предстательной железы РПЖ занимает второе место по смертности от онкологических заболеваний у мужчин. Своевременное распознавание злокачественного процесса является ключевым этапом при лечении рака, поскольку именно этот фактор именно определяет прогноз заболевания и терапию. Поэтому разработка и внедрение в практику быстрых, чувствительных и недорогих методов анализа приобретает все большее значение. Для диагностики злокачественных новообразований и контроля за лечением в настоящее время широко используются опухолеассоциированные антигены онкомаркеры, определяемые в сыворотке крови с помощью специфических моноклональных антител. Их уровень в крови, как правило, коррелирует с размером опухоли или стадией заболевания. Простатический специфический антиген ПСЛ относится к наиболее эффективным маркерам рака предстательной железы, получившим широкое внедрение в клиническую практику в целях диагностики и мониторинга РГ1Ж. Остро стоящая перед клиницистами проблема дифференциальной диагностики РПЖ и доброкачественных заболеваний ПЖ требует повышения специфичности ПСА как опухолевого маркера. Использование для диагностики двух форм ПСА общей и свободной позволяет ближе подойти к решению этой проблемы использование соотношения свободного и общего ПСА способствует значительному увеличению специфичности ПСА как опухолевого маркера в дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных заболеваний ПЖ. Количественный анализ онкомаркеров проводится иммунохимическими методами ИФА в основном на плашках стрипах. Традиционные иммунологические методы позволяют выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, в то время как для постановки точного диагноза требуется анализ на содержание в крови нескольких онкомаркеров. ПСА с использованием трехмерных гидрогелевых микрочипов. ГЛАВА 1. Злокачественная трансформация клеток вызывается нарушениями в генах, отвечающих за регуляцию их деления, дифференцировки и программированной гибели апоптоза. Мутации генов явление случайное, но селективный отбор мутантных клеток делает родоначальниками опухоли только те клетки, которые независимы от регуляторных сигналов организма. Для формирования злокачественности необходимо 6 генетических событий, хотя общее число мутаций в опухолевых клетках может составлять тысячи 1. Как правило, вся опухолевая масса является потомками одной клетки, поэтому и мутации передаются всем клеткампотомкам. Можно рассматривать специфические генетические дефекты как опухолевые маркеры и использовать это обстоятельство в диагностических целях 1,3,. Определение мутантных генов и их РНКпродуктов составляет основу молекулярногенетической диагностики онкологических заболеваний. Генетические нарушения, имеющиеся в опухолевых клетках, приводят к изменению синтеза белков, в том числе синтезу мутантных форм, нарушениям экспрессии повышении или снижении синтеза того или иного белка, появлению белков, характерных для эмбрионального периода развития.