Функциональный полиморфизм липофильных антиоксидантов в средах роста и клетках микроорганизмов

• Автор: Меньшов, Валерий Александрович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 208 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Липиды как питательный субстрат микроорганизмов

2.2. Влияние экзогенных липидов на физикохимические свойства внешней мембраны

2.3. Роль АО в жизнедеятельности микроорганизмов

2.4. Метаболизм микроорганизмов в условиях дефицита железа

2.5. Взаимосвязь метаболизма липидов и АО у бактерий

2.6. Цитотоксичность сидерофоров. Применение биохелаторов

в клинической практике.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1.1. Объекты исследования
3.1.1.1. Бактерии.
3.1.1.2. Дрожжи.
3.1.1.3. Препараты клеточных оболочек дрожжей.
3.1.2. Питательные среды для культивирования микроорганизмов.
3.1.3. Условия культивирования микроорганизмов.
3.1.4. Подсчет титра микробных клеток
3.1.5. Методика биотестирования токсичности
3.1.6. Обработка АПС препаратами КОД.
3.1.7. Методика выделения липидов
3.1.8. Определение антиокислитсльной активности липидов на мстилолеатной окислительной модели.
3.1.9. Методика йодометрического определения пероксидов
3.1 Методика количественного определения стеринов в липидах
3.1 Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии.
3.1 Определение содержания атокоферола в липидах
3.1 Измерение микровязкости мембран микроорганизмов
3.1 Качественное и количественное определение бактериальных эндотоксинов липополисахаридов с использованием лизата амебоцитов Ыши1и РугоюН ЛАЛтсст.
3.1 Определение активности микробиальных сидерофоров феррозиновым методом.
3.1 Статистическая обработка данных.
3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.2.1. Влияние нативных АО на стабильность состава и свойств липидов в изолированных клеточных стенках дрожжей
при их хранении
3.2.1.1. Общая характеристика липидов клеточных оболочек дрожжей КОД.
3.2.1.2. Изменение состава и свойств липидов КОД при хранении
3.2.2. Исследование функциональных свойств липофильных АО в механизме взаимодействий биосорбентов с липидами питательной среды
3.2.2.1. Изменение состава и АОА липидов АПС при центрифугировании.
3.2.2.2. Влияние клеточных оболочек дрожжей на состав, содержание и свойства липидов АПС
3.2.2.3. Корреляционнорегрессионный анализ взаимосвязи сорбционных и кинетических характеристик липидов КОД.
3.2.2.4. Анализ кинетических кривых окисления липидов методом специальных графических построений.
3.2.3. Кинетические и биологические свойства липофильных АО в средах роста условнопатогенных грамотрицатсльных бактерий
3.2.3.1 Взаимосвязь метаболизма липидов и липофильных АО
в средах роста УП ГНБ
3.2.3.2 Влияние липидов из сред после роста бактерий на кинетику окисления метилолеата
3.2.4. Метаболизм липофильных АО в клетках дрожжей.
3.2.4.1 Метаболизм липофильных про и антиоксидантов в глубинной культуре дрожжей.
3.2.4.2 Координация параметров системы регуляции ПОЛ мембран в зависимости от морфотипа дрожжей.
3.2.4.3 Свойства липофильных АО в средах роста пленчатых дрожжей.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АО антиоксидант, антиоксидантныи АОА антиокислительная активность АП антипероксидант, антипсроксидный АЛА антипероксидная активность АПС арахисовая питательная среда БС биосорбент ДФО дсферриоксамин ЖК жирная кислота, жирнокислотный Ю1 кардиолипин
КОД клеточные оболочки дрожжей
ЛВС лиофильновысушенный
ЛПС липополисахарид
ЛФЛ лизофосфолипиды
МеО метилолеат, мстилолсатиый
ОЛ общие липиды
ПНЖК полиненасыщенные жирные кислоты ПОЛ псрскиснос окисление липидов СМ сфингомислин ТАГ триацилглицериды ТФ атокоферол
УП ГНБ условнопатогенные грамнегативные бактерии
ФЛ фосфолипиды, фосфолипидный
ФГ фосфатидил глицерин
ФИ фосфатидилинозит
ФК фосфатидная кислота
ФС фосфатидилсерин
ФХ фосфатидилхолин
ФЭ фосфатидилэтаноламин
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В клетках i комплекс ферментовсинтетаз, отвечающих за синтез ЖК, быстро исчезал при достижении стационарной фазы роста даже в условиях, когда среда исходно не содержала ЖК. Установлено, что факультативные анаэробы, такие как . ЖК в качестве единственного источника углерода, при условии, что конечным акцептором электронов респираторной цепи является нитрат. Интересно, что анаэробный рост бактерий в присутствии ЖК не регулируется фактором транскрипции , как это имеет место при аэробных условиях . Некоторые липофильные дрожжи и плесени в лимитированной по углероду питательной среде способны использовать резервные липиды для производства новой биомассы, для чего липиды предварительно выделяются в среду обитания культуры . У бактерий такой механизм не обнаружен, хотя он и не исключен, учитывая, что бактерии запасают впрок полигидроксиалкановые кислоты, используемые клетками в стадии голодания в качестве резервного источника углерода и энергии 7. Влияние экзогенных липидов на физикохимические свойства внешней мембраны микроорганизмов. Важным звеном в механизме утилизации липидов и повреждающего воздействия гидрофобных токсикантов является адсорбция липофильных соединений клеточной поверхностью бактерий и дрожжей. По степени гидрофильности поверхности различают гладкие и шероховатые типы клеток. Присутствие гидрофильных полисахаридных молекул на поверхности внешней мембраны бактерий способствует ее гидрофилизации гладкий тип, тогда как укорачивание длины полисахаридных молекул увеличивает гидрофобность шероховатый тип. Зйдоподпоза и других бактериях изменение структуры лнпополисахаридных молекул внешней мембраны влияет на гидрофобность клеточной поверхности. Амфифильная природа молекул ЛПС является результатом ковалентного соединения трех структурных элементов липида А, олигосахарида кора и полисахаридного Оантигена. Оантигенный участок контактирует с окружающей средой и непосредственно определяет неспсцифичсские свойства клеточной поверхности, такие как гидрофобность 5. Относительно гидрофильная поверхность проницаема для малых ММ до 0 гидрофильных молекул и не проницаема для гидрофобных 3. Многие гидрофобные антибиотики неэффективны в отношении ГИБ как раз в силу плохой проницаемости внешнего липополисахаридного слоя. Интересно, что в присутствии бактериальных ФЛ, проницаемость этого слоя для антибиотиков резко возрастала 8. Не исключено, что увеличение содержания ФЛ в токсичных средах культивирования бактерий имеет прямое отношение к механизму утилизации липидов клетками 8. ЛПС цепь и Бцспь. Более короткая цепь ЛПС состоит из рамнозных трисахарндных единиц, в то время как более длинная Бцепь содержит многочисленные моносахаридныс молекулы, также как и ди и пснтасахаридныс единицы 4. Изменение условий роста бактерий может повлиять на экспрессию ЛПС и, как результат, на свойства клеточной поверхности. Например, рост бактерий на нгексадекане приводит к сокращению структуры ЛПС и увеличению гидрофобности клеточной поверхности . Мутанты с отсутствующей Бцепью имели увеличенную гидрофобность и адгезию к полистирену 5. При сравнении динамики роста и гидрофобности поверхности бактерий, образующих шероховатые и гладкие колонии, установлено, что при росте на глюкозе клетки содержали высокомолекулярную отрицательно заряженную Бцепь ЛПС и низкомолекулярную нейтральную цепь, что обеспечивало низкую гидрофобность поверхности. При выращивании обоих фенотипов на апканах Ацспи ЛПС не меняли структуру, тогда как Бцепь была укорочена, что обеспечивало большую гидрофобность клеточной поверхности 7. Иной механизм увеличения гидрофобности поверхности при утилизации алканов обнаружен у бактерий и дрожжей, синтезирующих биосурфактанты 6. Деградация гексадскана синтезирующими рамнолипиды бактериями . Как оказалось, рамнолипид увеличивает гидрофобность поверхности и адгезию к ал ка нам путем экстракции гидрофильного ЛПС из внешней мембраны. Стимулирующий эффект рамнолипида связан также с улучшением растворимости гидрофобных молекул в водной среде 6. Сурфактанты, синтезируемые i i, влияли не только на гидрофобность, но и на дзетапотенциал клеточной поверхности 1.