Белок-белковые взаимодействия в мембране: димеризация трансмембранных сегментов мембранных белков

• Автор: Гончарук, Марина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ.

1.2. ПЕРЕДАЧА ИНФОРМАЦИИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ.

1.2.1. Гликофорин А человека.

1.2.2. Сенсорная киназа . i

.2.З. Проапоптозный белок i3.

1.2.4. Семейство ЕгЬВ

.2.4.2. ЕгЬВ.
2.4.2. ЕгЬВ 2.
.2.4.3. ЕгЬВЗ.
.2.4.4. ЕШ.
1.2.5. Эфриновые рецепторы .
1.3. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ .i
1.3.1. Основные подходы для получения трансмембранных сегментов
в клетках . i
1.3.2. Основные возникающие проблемы и как с ними бороться
1.3.3. Прямая экспрессия.
1.3.4. Гибридная экспрессия
1.4. СТРУКТУРНАЯ БИОЛОГИЯ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ.
1.4.1. Кристаллография рентгеноструктурный анализ и другие
методы
1.4.2. Спектроскопия ЯМР.
.4.3. Рентгеноструктурный анализ или спектроскопия ЯМР
1.4.4. Другие методы
1.4.5. Изучение димеризационной способности трансмембранных
сегментов в мембране бактерии.
Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
II. 1. МАТЕРИАЛЫ
II. 1.1, Штаммы .i
II. 1.2. Вектора и плазмиды.
И. 1.3. Среды для выращивания . i
II. 1.4. Ферменты.
II. 1.5. Олигонуклеотиды
II. 1.6. Реактивы.
II.2. МЕТОДЫ
.2.1. Полимеразная цепная реакция ПЦР
.2.2. Рестрикция.
.2.3. Лигирование
П.2.4. Электрофорез ДНК.
.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
П.2.6. Выделение плазмидной ДНК из . i
.2.7. ПЦР анализ клонов
.2.8. Секвенирование ДНК.
.2.9. I трансформация клеток . i плазмидной ДНК
.2 Конструирование экспрессионных векторов X 1X пептид.
.2 Денатурирующий электрофорез белков в ДСНПААГ
.2 Иммуноблот.
.2 Подбор условий индукции ИПТГ.
.2 Выращивание рекомбинантного штамма .i
.2 Буфера, используемые при выделении белков
.2 Выделение гибридных белков X, Xii3, X, X, X2, X3, X4, X и X2 из клеток . i
.2 Получение трансмембранных пептидов , i3, , , 2, , 4, и 2
.2 Солюбилизация трансмембранных пептидов
.2 Спектроскопия ЯМР, расчет пространственных структур и МДрелаксация.
.2 Изучение димеризационной способности трансмембраниых пептидов в мембране .i система x
.2 Снятие спектров кругового дихроизма КД
.2 Динамическое светорассеяние.
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
III. 1. Разработка универсальной системы экспрессии синтетических генов трансмембрапньтх пептидов в клетках .i.
1.2. Конструирование экспрессионных векторов XX пептид.
1.3. Оптимизация условий культивирования рекомбинантных штаммов
. i
1.4. Очистка гибридных белков X пептид
П1.5. Очистка трансмембранных пептидов.
1.6. Спектроскопия ЯМР, расчет пространственных структур и релаксации методОхМ молекулярной динамики МД.
1.7. Определение степени ассоциации трансмембранных участков мембранных белков в клеточной мембране
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


ТМС в активации и функционировании, раскрытие пространственной структуры МБ, заложат основу современного подхода к рациональному дизайну лекарственных препаратов нового поколения, например, основанному на синтетических пептидах, регулирующих свойства и функции рецепторов и каналов биологической мембраны. Целью дайной диссертационной работы является изучение белокбел ковых взаимодействий в составе димерных комплексов различных ГМ пептидов в мембране иили мембраноподобном окружении. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи а разработка универсальной системы эффективной экспрессии синтетических генов ТМ пептидов в клетках . ТМ пептидов б изучение процессов димеризации ГМ пептидов i vi в средах, имитирующих биологическую мембрану, при помощи оптических методов анализа, спектроскопии ядерного магнитного резонанса ЯМР высокого разрешения и методов молекулярного моделирования в изучение димеризационной способности ТМ сегментов в бактериальной мембране. Глава I. Основными компонентами биологических мембран являются молекулы липидов и гликопротеинов 4. При этом белки являются активными компонентами мембраны. В зависимости от прочности ассоциации с мембраной МБ подразделяют на периферические и интегральные. Критерием служит степень жесткости обработки, необходимой для извлечения белков из мембраны. К периферическим относят белки, которые легко вымываются из мембран растворами солей или даже дистиллированной водой. Такие белки способны обратимо связываться с бислоем и часто совершают челночные перемещения между мембраной и се окружением. Некоторые из этих белков связываются с заряженными группами липидов мембран за счет электростатических взаимодействий Рис. В качестве примеров можно привести миелиновый основный белок, протеинкиназу С, фосфолипазы. Существует также ряд белков, адсорбирующихся на мембранных гликолипидах и гликопротеинах посредством углеводбел кового иили белокбелкового взаимодействия Рис. Этот тип взаимодействий реализуется, например, при связывании 1субъединицы йГАТФазы с погруженной в мембрану субъединицей. Интегральными считают МБ, частично или полностью пронизывающие липидный бислой. Такие белки характеризуются сильным гидрофобным взаимодействием их мембранных областей с липидным окружением. Интегральные МБ удается солюбилизировать только при помощи детергентов. По типу связывания с мембраной такие белки можно подразделить на ТМ Рис. Рис. Рис. Разнообразие мембранных быков МБ. Сконцевым пептидным якорем Л. Ыконцевой якорь 7. Рис. Рис. ТМ белки различаются числом полипептидных участков, пересекающих бислой, и могут содержать один Рис. А, или несколько Рис. АТФаз, бактериородопсина и др. МБ с одним или несколькими ТМ доменами Рис. Рис. Рис. Рис. Многие интегральные белки животного происхождения связываются с плазматическими мембранами клеток за счет гидрофобного якоря, при этом большая часть молекулы гликозилирована и локализуется с наружной стороны мембраны. Некоторые из этих белков прикрепляются к мембране посредством ковалентно связанного гликозилфосфатидилинозитольного ОР1 якоря Рис. Подобный способ связывания характерен для щелочной фосфатазы, ацстилхолинэстеразы и др. Другие белки взаимодействуют с мембраной за счет ТМ пептидного якоря последовательности гидрофобных аминокислот, расположенной вблизи И или Сконца молекулы белка. Так, одни МБ Рис. Ы концевым сигнальным пептидом, отщепляемым в процессе биосинтеза, и Сконцевым якорем. В случае других белков Ыконцевой сигнал в процессе биосинтеза не отделяется и играет роль ТМ якоря Рис. Отметим, что для многих белков, встроенных в мембрану с помощью якоря, характерно слущивание с клеточной поверхности, при котором они оказываются в растворимом виде во внеклеточном пространстве, а якорь остается в мембране. При этом гидрофобные мембранные области представлены, в основном, либо аспиральными участками 5, 6, 7, либо ртяжами 8, 9. Так, например, МБ с ТМ ртяжами обнаружены в составе внешней мембране фамотрицательных бактерий, в мембранах митохондрий и хлоропластов, где они формируют жесткие поры, так называемые Рбочонки.