Исследование условий формирования рельефа гидрофобной поверхности скола модельных и биологических мембран

• Автор: Тараховский, Юрий Семенович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 152 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ стр.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛ. Метод криоскалывания в исследовании биологических мембран

1.1.1. Методологические проблемы криоскалывания

1.1.2. Интерпретация изобракений сколов биологических мембран

1.2. Структурная организация и топография мембран

микросом печени

1.2.1. Структура ыикросомальных мембран

1.2.2. Поперечная топография микросомальных мембран

1.2.3. Продольная топография микросомальных мембран

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Электронная микроскопия
2.2. Препаративные методы
2.3. Аналитические методы
2.4. Солюбилизация и реконструкция мембран
2.5. Методы физического и химического воздействия на мембраны
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Формирование ВМЧ в искусственных мембранах
3.1.1. Полиморфные превращения кардиолипина и смеси кардиолипинлецитин в присутствии двухвалентных катионов
3.1.2. Влияние ионов Са на морфологию мембран из Мацетилфосфатидилэтаналамина
3.1.3. Участие периферических белков в формировании ВМЧ
3.2. Формирование ВМЧ в тенях микросомальных мембран
печени
3.2.1. Ультраструктурная характеристика теней микросомальных мембран
3.2.2. Формирование ВМЧ в тенях микросом с изменнным химическим составом
3.2.2.а. Индукция синтеза цитохрома Р0 ксенобиотиками
3.2.2.6. Изменения ультраструктуры мембран при обработке гидролитическими ферментами
3.2.3. Самосборка и реконструкция теней микросом
3.2.3.а. Самосборка микросомальных мембран после солюбилизации детергентами
3.2.3.6. Ультрафрагментация микросомальных мембран и реконструкция мембранных фрагментов
3.2.3.в. Реконструкция отдельных компонентов микросомальных мембран
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Скалывание, как и две последующие операции травление и напыление реплики, проводят в условиях высокого вакуума ДО6 4 торр. Скалывание осуществляют либо путем срезания замороженного препарата ножом, либо разрывом капельки препарата, вмороженного между двумя металлическими пластинами. В обоих случаях получается аналогичный результат . Основным артефактом в процессе скалывания являются пластические деформации ,,,6, которые возникают в результате сохранения пластических свойств биологического материала вплоть до очень низких температур. Так,фосфолипиды сохраняют некоторую подвижность углеводородных цепочек вплоть до температуры жидкого азота . Уменьшить эффект пластических деформаций можно путем понижения температуры, при которой производится скалывание, но при 4К, по мнению некоторых авторов, пластические деформации сохраняются. В значительной мере их мозкно устранить химической фиксацией 8. Экспонирование поверхности скола под вакуумом. От момента скалывания до момента напыления реплики проходит некоторое время, в течение которого с поверхности скола может испариться некоторое количество воды и сорбироваться некоторое количество газов ,,3. При подъеме температуры препарата от 6С до 0С скорость испарения льда резко возрастает, что позволяет достаточно эффективно обнажать структуры, скрытые поверхностью льда. В процессе травления на поверхности материала всегда остается неудаляемый слой сорбированной боды,. Поэтому вакуум должен быть не менеулибо температура, при которой осуществляется скалывание, не должна опускаться нике 0 4 0С . Главным артефактом, связанным с сорбцией газов на поверхности скола мембраны, является увеличение размеров ВМЧ и появление капелек сорбированного материала, которые препятствуют наблюдению истинных структур ,,3. Формирование реплики. Процесс формирования реплики путем напыления на поверхность скола электронноплотного материала называется репликацией. Обычно репликацию осуществляют в два этапа. Сначала под углом напыляют платиновоуглеродную смесь, благодаря чему формируется изображение. Далее, для повышения прочности реплики, строго вертикально напыляют углерод . Плавление поверхности скола, связанное с излучением значительной тепловой энергии источником напыления. Однако если источник напыления находится на достаточном удалении от образца не менее см, то этот эффект значительно ослабевает. Особенно благоприятным является использование электронных пушек. Зернистость реплики, связанная с тем, что конденсирующиеся молекулы распыляемого материала не остаются в точках столкновения с поверхностью скола, а реорганизуются и создают маленькие кристаллики. Использование других материалов, таких как вольфрам, тантал, иридий и т. Поскольку реплика имеет некоторую толщину, определение размеров объекта может оказаться ошибочным. Обычно толщина напыляемого слоя платины не должна превышать , при этом обеспечивается достаточный контраст изображения. Интерпретация изображений сколов биологических мембран. Метод криоскалывания позволяет исследовать обширные мембранные поверхности, характеризующиеся определенной топографией и динамикой структурных изменений. Для правильной интерпретации полученных изображений необходимы знания механизмов раскалывания мембран и формирования рельефа. В году Д. Брайтон, исследуя сколы мембран корешков лука до и после экстракции липидов, пришел к выводу, что скол проходит по гидрофобной области мембраны. В последствии Д. Брайтон с соавторами провел серию работ, доказывающих правильность этой гипотезы ,. Среди них,прежде всего, следует упомянуть эксперимент по раскалыванию искусственной мембраны из меченной по стеариновой кислоты, вмороженной между двумя стеклянными поверхностями. После раскалывания метку можно было обнаружить на обеих поверхностях стекла. Заслуживает внимания также эксперимент с тенями эритроцитов, меченными на поверхности ферритином. В этой работе также показано, что молекулы ферритина обнаруживаются только после травления, т. На поверхности скола мембраны ферритиновых частиц обнаружить не удавалось.