Биофизические основы создания новых ферментных препаратов пролонгированного действия

• Автор: Зелепуга, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 171 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

. Применение ферментов В МеДИЦИНе мм.ман4мннммам.ммм1на1м.нм.ммм.нн.ниннатнмн4.н

1.2. Модификация ферментов . .

1.2.1. Функциональные группы белков.

1.2.2. Модификация белков природными и модифицированными природными полимерами

1.2.3. Модификация синтетическими полимерами

1.2.3.1. Системы депонирования белковых лекарств в организме.

1.2.3.2. Модификация белков монофункциональными полимерами.

.3.3. Синтетические полифункциональные полимеры
1.2.4. Ферментбел ковые конъюгаты
1.2.5. Проблемы биоконъюгации.
1. Механизмы биологического действия РНКаз.
1.4. Факторы, необходимые для проявления РНКаэами биологического действия
1.5. Сывороточный альбумин человека САЧ
1.5.1. Метаболизм и распределение альбумина
1.5.2.1. Аминокислотная последовательность альбумина
1.5.2.2. Вторичная структура и доменная организация
1.5.2.3. Пространственная структура молекулы альбумина в растворе
1.5.2.4. Распределение аминокислотных остатков и зарядов.
1.5.3. Физикохимические свойства молекулы САЧ.
1.5.4. Влияние физикохимических факторов на структуру и свойства альбумина.
1.5.4.1. Влияние значения среды.
1.5 Денатурация макромолекулы САЧ
1.5.4.2.1. Температурная денатурация.
1.5.4 Влияние мочевины на структуру САЧ
1.5.5. Функции альбумина в организме
1.5.5.1. Связывающие центры альбумина
1.5.5.1.1. Главные центры неспецифического связывания лекарственные
1.5.5.1.2. Центр связывания двухвалентных катионов.
1.5.5.1.3. Тиоловая группа остатка .
1.5.5.1.4. Центры связывания неэтерифицированных жирных кислот.
1.5.5.1.5. Минорные центры.
1.5.5.1.6. Билирубин связывающие центры
1.5.6. Группы молекулы САЧ, доступные для химической модификации
1.6. Получение конъюгатов ферментов с белками при помощи глутарового альдегида
1.6.1. Химическое поведение глутарового альдегида в растворе
1.6.2. Взаимодействие ГА с белками
1.6.3. Факторы, определяющие успешную иммобилизацию ферментов.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и методы
2.2. Хараетернстика химических реастивов .
ХИрЗКТСрИСТИКЗ НСПОЛЬЗуСМЫХ бСЛкОВмммжжмимм1мммннжнннмни1Интиммннм
2.3.1. Рибонуклеаза из i Ii 7р
2.3.2. Бычья панкреатическая рибопуклеаза.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конъюгаты ферментов с сывороточным альбумином человека, их получение и характеристики
3.1.1. Получение и исследование физикохимических свойств безлигандного сывороточного альбумина человека
3.1.2.Способ получения конъюгатов ферментов с БЛСАЧ.
3.1.3. Исследование физикохимических характеристик конъюгатов и их биологической активности i vi
3.1.3.1. Ферментативная активность конъюгатов
3.1.3.2. Определение молекулярной массы конъюгатов.
3.1.3.3. Активность конъюгатов БЛСАЧ и панкреатической РНКазы в отношении двунитевой РНК
3.1.4. Способ очистки конъюгатов от примесных агрегатов САЧ.
3.1.5. Изучение биологической активности конъюгатов i viv.
3.1.5.1. Пролонгация действия модифицированного фермента в организме.
3.1.5.2. Исследование проникновения панкреатической рибонуклеазы через гематоэнцефалический барьер .
3.2. Компьютерное моделирование межмолекулярных комплексов БЛСАЧ и РНКазы А
3.2.1. Молекулярный докинг обезжиренного альбумина и РНКазы А.
3.2.2. Анализ поверхности контактов предполагаемых комплексов
3.2.3. Анализ влияния взаимодействия РНКазы А и обезжиренного САЧ на активность фермента.
3.2.4. Анализ структуры центров связывания РНКазы А макромолекулы албьумина
3.2.5. Анализ возможных взаимодействий макромолекул в составе полимерного комплекса
3.2.6. Гидрофобные взаимодействия.
3.2.7. Конформационный анализ
3.2.8. Предсказание биологической активности БЛСАЧмодифицированных ферментов РНКаз
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК РАБОТ, В КОТОРЫХ ОПУБЛИКОВАНО ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


В настоящее время для биоконъюгации используется несколько монофункциональных полимеров, таких как ПЭГ, новая форма полиСУУвинилпирролидон и полиУакрилоилморфолин , полиоксазолины, поливиниловый спирт . Использование наиболее изученного среди них ПЭГ одобрено Обществом по питанию и лекарственным препаратам США для использования в медицине, продуктах питания и косметологии, поскольку этот полимер не токсичен, не иммуногенен, не антигенен и хорошо растворим в воде , , . Модификация с использованием ПЭГ получила название пегилирование. Таким образом, были получены и уже выпущены на рынок конъюгаты ПЭГаспарагиназа , , который используется в терапии острой лимфобластной лейкемии , и два ПЭГконъюгата аинтерферона , и I i , применяемые для борьбы с различными формами инфекционного гепатита С. Также в лечебной практике используются конъюгированные с ПЭГ белки, такие как ингибитор агпротеиназы человека , i . Данный метод модификации позволяет значительно увеличить время жизни препаратов в организме, снизить или исключить иммуногенность и повысить устойчивость в отношении метаболических ферментов. Такая модификация обычно значительно улучшает терапевтическую эффективность белков . Например, действие препарата I в 3 раза эффективнее модифицированного интерферона. РНКаза семени быка РНКаза, находясь в конъюгате с ПЭГ, обладает очень низкой антигенностыо и колоссальной антиопухолевой активностью в сравнении с нативным ферментом . Некоторые ПЭГпроизводные супероксидисмутазы уже находятся на стадии клинических испытаний. Они показали более медленное всасывание конъюгата при подкожном или внутримышечном введении и значительный рост времени пребывания в организме после внутривенного введения от мин для нативного фермента до нескольких суток для ПЭГкоиъюгатов . На примере модификации таких ферментов, как аспарагиназа и уриказа разветвленным полимером разветвленный ПЭГ показано, что модификация полимерами такого рода позволяет добиваться более высокой степени предохранения конъюгированных белков от протеолитической деградации и более эффективного снижения антигенности и иммуногеиности по сравнению с модификацией фермента линейным полимером, связанным в равном количестве на один аминокислотный остаток белка. ПЭГконъюгаты имеют не только преимущества перед нативным белком. Как и все синтетические полимеры, ПЭГ полидисперсен, т. Гауссово распределение молекулярных весов. Это приводит к образованию популяции конъюгатов, которые могут иметь различные биологические свойства. Эти различия касаются преимущественно времени жизни препаратов в организме и их иммуногеиности. К основным недостаткам модифицированных таким образом белков и пептидов относятся и возможное уменьшение активности белка, и удлинение элиминации пептидов, часто связываемые с проблемой правильного подбора структуры и размера ПЭГ . В результате пегилирования, как правило, ослабляется связывание с рецепторами . Кроме того, как и другие полимеры, ПЭГ, как правило, выводится с мочой или через гастроэнтерологический тракт, но при большой молекулярной массе он может аккумулироваться в печени, приводя к макромолекулярному синдрому. Совсем непростую задачу представляет определение безопасного порога почечного клиренса для ПЭГ, поскольку очень важную роль играют другие факторы. Например, высокая способность ПЭГ к связыванию воды увеличивает гидродинамический объем полимера в раз по сравнению с объемом глобулярного белка, имеющего аналогичную молекулярную массу, и таким образом снижает порог почечного клиренса . Вследствие всего вышеизложенного максимальная молекулярная масса ПЭГ, используемого для конъюгации белков, не превышает КДа для разветвленного полимера . Возможное сокращение длины полимерной цепи или утрата одной из цепей в случае разветвленного полимера под воздействием ферментов i viv например, цитохрома Р0 или алкогольдегидрогеназы может привести к изменению биологических свойств препарата, что показывает, насколько сложно прогнозировать поведение полимерных конъюгатов i viv, исходя из данных i vi.