Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания

• Автор: Крындушкин, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Молекулярные механизмы белковой наследственности.

Феномен прионов.

1. Прионы млекопитающих

1.1. Прионы новый класс инфекционных агентов.

1.2. Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком РгР8

1.3. Доказательства прионной гипотезы

1.3.1. Использование экспериментальных животных для исследования инфекцнонности прионов. Существование межвидового барьера

1.3.2. Изучение прионов млекопитающих с помощью трансгеиных животных

1.3.3. Взаимодействие РгР и РгР . Изучение прионного превращения белка РгР i vi. Штаммы прионов
1.4. Молекулярные модели прионного перехода
1.5. Предполагаемая функция белка РгР. Может ли патологический эффект объясняться инактивацией белка
1.5.1. Структура белка РгР. Си2связывающая активность РгР
1.5.2. Роль белка РгР в защите клеток нервной системы
2. Прионы низших эукариот.
2.1. Нехромосомные детерминанты и 3 дрожжей vii. Цитоплазматический детерминант гриба i
2.2. Молекулярная природа детерминанта прионный переход белка
2.2.1. Структура и функция белка . Роль концевого домена в
возникновении и поддержании детерминанта .
2.2.2. Экспериментальные доказательства прионных свойств белка
2.2.3. Мутации в гене , приводящие к потере прионного детерминанта . Штаммы прионного детерминанта ЛГ
2.3. Создание гибридного приона на основе концевого домена ортолога
из дрожжей ii i.
2.4. Сходство прионной формы белков и 2 с амилоидами млекопитающих. Структура амилоидных фибрилл
2.5. Биологическое значение прионов низших эукариот.
3. Клеточные факторы, влияющие ня поддержание прионного состояния
белков
3.1. Шапероны классификация и функциональное значение.
3.2. Влияние шаперонов на прионный переход РгР i vi и i viv.
. Роль шаперона в поддержании детерминанта I. Действие на I обусловлено инактивацией
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 4i
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Штаммы, среды, условия культивирования
2. Генетические методы. Трансформация микроорганизмов
3. Конструирование плазмид и другие генноинженерные манипуляции.
4. Конструирование штаммов с делениями 8 и 1. Гибридизация по Саузсрну
5. Измерение Ргалактозидазной активности в клетках дрожжей и определение
эффективности сквозного прочтения нонсенскодонов
6. Белковый гельэлектрофорез и иммуноблоттинг.
7. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов.
Ультрацентрифугирование. Сравнение полимеров и агрегатов
8. Экспрессия в . i и аффинная очистка белка 6i. ДНКбелковое
связывание i vi ii i .
9. Прионная конверсия белка i vi
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Сверхэксирессия дрожжевых шанеронов семейства ослабляет
супрессорный фенотип детерминантов и V, приводя к элиминации некоторых штаммов этих детерминантов.
2. Систематический поиск белков, участвующих в элиминации прионного
детерминанта к
3. Механизмы антнприонного эффекта идентифицированных белков
3.1. Избыток транскрипционных регуляторов 8 и , а также делеции соответствующих генов, влияют на профиль экспрессии шаперонов в дрожжевой клетке .
3.2. связывается с промоторной последовательностью
3 . Роль кислого рибосомного белка в поддержании детерминанта 7.
3.3.1. Сверхэкспрессия гена 0 приводит к накоплению белка в дрожжевой клетке.
3.3.2. Обнаружение избытка во внерибосомных комплексах
3.3.3. , накапливаясь при сверхэкспрессии, влияет на экспрессию некоторых белков в клетке
3.4. Шалероны семейств и основные антиприонные белки в
дрожжевой клетке
4. Разработка электрофоретического метода анализа прионных агрегатов
4.1. Подбор реагентов и условий для очистки прионных агрегатов
4.2. Описание элетрофоретического метода. Оценка размера прионных агрегатов
4.3. Прионные агрегаты ДЙ состоят из полимеров белка БирЗб.
4.4. Различным штаммам детерминантов ДХ и РЭГк соответствуют прионные полимеры разного размера
5. Влияние различных антиприонных воздействий на размер прионных
полимеров.
5.1. Добавление к растущим дрожжевым клеткам виНС в низкой концентрации полностью блокирует репликацию прионного детерминанта.
5.2. Уменьшение количества шаперона Нр4 приводит к увеличению размера прионных агрегатов
5.3. Увеличение экспрессии шаперона Нвр4 приводит к увеличению размера прионных агрегатов
5.4. Избыток шаперона , а также коэкспрессия аллели 1РР2 приводят к уменьшению скорости прионного перехода
6. Разработка метода препаративного выделения прионных агрегатов для
анализа их структуры
6.1. Подбор условий для метода препаративного выделения прионных полимеров
6.2. Полимеры 8ир имеют фибриллярную форму и способны инициировать прионный переход мономерного белка 8ир
ДИСКУССИЯ.
1. Белки, влияющие на стабильность прионных детерминантов у дрожжей сегеЫае.
1.1. Шапероны, элиминирующие дрожжевые прионы
1.2. Антиприонные белки, не относящиеся к шалеронам, влияют на уровень
экспрессии стрессиндуцируемых генов.
2. Полимеры и агрегаты два уровня в структуре лрионов дрожжей
3. Штаммы и IР5де различаются по свойствам полимеров 8цр и 8ирР8 соответственно
4. Белок Нр4 разбирает крупные прнонные агрегаты и фрагментирует прионные полимеры
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Возможно, феномен прионов гораздо шире распространен в природе и играет существенно большее значение у различных организмов, чем это известно на сегодняшний день. Поиск в геномных базах выявляет значительное количество белков у различных организмов, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей. Это наводит на мысль о том, что белки со способностью приобретать альтернативную само поддерживающуюся конформацию широко распространены и могут играть важную роль в регуляции физиологических процессов в клетке. Особое значение данная проблема получила в силу появившихся в последнее время сообщений о возможности передачи данных заболеваний от животных к человеку при употреблении в пищу мяса больных животных. Ввиду того, что дрожжевые прионы сходны по своим принципиальным свойствам с прионами млекопитающих, изучение механизмов образования и элиминации прионов у дрожжей позволит глубже понять патогенез прионных заболеваний и разработать подходы к их терапии. Таким образом, на сегодняшний день актуальной представляется задача поиска белков, критичных для поддержания прионного детерминанта у дрожжей. Подобные белки могли бы в перспективе быть использованы как молекулярное лекарство для лечения прионных заболеваний человека и животных. Регуляция экспрессии таких белков в клетке также может представлять интерес как для биологии, так и для медицины. Данная диссертационная работа включает в себя попытку реализации этого замысла с использованием дрожжевого прионного детерминанта. Несмотря на наличие доказательств прионный гипотезы для ряда белков млекопитающих и низших эукариот, на сегодняшний день получено очень мачо данных о структурной организации прионов. Практически все имеющиеся данные получены в экспериментах, проводимых с прионными белками i vi. Отсутствие структурных данных существенно затрудняет понимание процессов, происходящих в клетке на молекулярном уровне. Поэтому одной из задач нашей работы явилось создание нового методического подхода, дающего информацию о структуре прионов дрожжей, а также использование этого метода для изучения механизмов их репликации. Подобный методический подход может быть использован в будущем и для анализа других прионных белков. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БЕЛКОВОЙ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ. Прионами называют инфекционные агенты белковой природы, вызывающие особый класс неизлечимых дегенеративных заболеваний центральной нервной системы человека и животных. Наиболее известные из подобных заболеваний человека это болезнь КрейцфельдаЯкоба и синдром ГертсманаШтраусслераШейнкера, а у животных скрэйпи овец и губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, называемые иногда в средствах массовой информации чесоткой овец и коровьим бешенством, соответственно. Эти заболевания, независимо от того, у кого они возникли у человека или животных, сопровождаются морфологическими изменениями тканей мозга к появлением в них фибриллярных структур, состоящих из нерастворимых белковых агрегатов, которые, как считают многие, и составляют инфекционное начало. Это придает им сходство с так называемыми амилоидными заболеваниями наиболее известна болезнь Альцгеймера, в которых также происходит образование морфологически похожих структур, но эти болезни не являются инфекционными. Необходимо добавить, что почти все заболевания такого рода на данный момент неизлечимы и являются смертельными для человека. Инфекционность прионных болезней была показана в шестидесятых годах прошлого века, в основном работами Д. Гайдушека Сабизек а1. Нобелевской премии. Классический пример инфекционности прионных болезней в человеческой популяции представляет собой эпидемия куру на островах Новой Гвинеи. Эта болезнь была связана с ритуальным каннибализмом, связанным с поеданием мозга и тканей умерших родственников в знак уважения к ним. С прекращением этого обычая исчезла и эпидемия. В дальнейшем было показано, что ткань мозга людей, умерших от данной болезни, содержала инфекционное начало, способное заражать человекообразных обезьян. Эти и подобные им исследования позволили выделить новый класс инфекционных нейродегенеративных заболеваний человека и животных.