Исследование протонного транспорта в хлоропластах с помощью рН-чувствительных спиновых меток

• Автор: Трубицин, Борис Вячеславович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с.

Содержание.

Список используемых сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Структурнофункциональная организация хлоропласта

1.1.1. Цепь электронного транспорта хлоропластов

Фотосистема 2.

Цитохромный Ькомплекс

Фотосистема

1.1.2. Протонный транспорт и фотофосфорилирование в хлоропластах.

1.1.2.1. Перенос протонов к АТРсинтазе

1.1.2.2. Структура АТРсинтазного комплекса
Строение фактора сопряжения С.
Строение фактора сопряжения СГ
1.1.2.3. Функционирование АТРсинтазы
1.1.2.4. Локальный и делокализовнный механизмы энергетического сопряжения.
1.1.3. Особенности регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах.
1.1.3.1. Явление фотосинтетического контроля.
1.1.3.2. Регуляция активности фотосинтетических ферментов
Регуляция распределения энергии поглощаемого света между фотосистемами
1.1.3.3. Рсдоксрегуляция фотосинтетических ферментов
1.1.3.4. Терморегуляция фотосинтеза
1.1.3.5. Роль фитохрома в регуляция фотосинтеза
1.2. Методы измерения величины Др
1.2.1. Флуоресцентные красители.
1.2.2. ЯМРснектроскопия.
1.2.3. Кинетический метод измерения АрН.
1.2.4 Спиновые метки
1.2.4.1. Использование в качестве зонда спиновой метки ТЕМПАМИ 1.
1.2.4.2. Использование имидазолиновых рНчувствительных радикалов.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Выделение хлоропластов.
2.2. Оценка функциональной активности хлоропластов
2.3. Регистрация и обработка спектров ЭПР.
2.3.1. Программное обеспечение
2.3.2. Получение разностных спектров ЭПР спиновых меток внутри гилакоидов
Глава 3.
Результаты и их обсуждение
3.1. Определение внутритилакоидного с помощью спиновой метки ТЕМПАМИН
3.1.1. Локализация ТА внутри тилакоида
3.1.2. Методы измерения рН1П с помощью спиновой метки ТЕМПАМИН
3.1.2.1. Регистрация метки внутри тилакоидов по увеличению внутреннего сигнала ЭПР.
3.1.2.2. Определение ДрИ но эффекту концентрационного уширения спектра ЭПР.
3.1.2.3. Сравнение концентрационных зависимостей параметров спектров различных спиновых меток
3.1.3. Количественное определение АрН по эффекту концентрационного
у ширения спектра ЭР спиновой метки ТЕМПАМИН.
3.1.3.1. Моделирование концентрационной зависимости параметров спектра
ЭПР спиновой метки ТЕМПАМИН.
Экспериментальные условия, влияющие на форму спектральной линии.
Моделирование суперСТС спектральной линии.
Зависимость ширины спектральной линии от концентрации спиновой метки.
3.1.3.2. Моделирование фотоиндуцированного поглощения ТА тилакоидами
Определение вида функции С.
3.1.3.3. Измерения лрН в различных условиях функционирования хлоропластов
3.2. Определение ДрН в хлоропластах с помощью i Iчувствительных спиновых меток имидазолиновые радикалы
3.2.1. Построение калибровочных кривых для измерения с помощью имидазолиновых радикалов
3.2.2. Измерения внутритилакоидного с помощью метки I
3.2.2.1. Получение разностных спектров ЭПР при освещении образца
3.2.2.2. Локализация метки в образце
3.2.3. Измерение величины ДрН в различных метаболических состояниях хлоропластов.
3.2.4. Зависимость лрансмембранной разности от внешней среды.
3.3. Изучение электронного транспорта в листьях методом ЭПР
3.3.1. Влияние неорганического фосфата на работу фотосинтетического аппарата растений.
3.3.2. Влияние экологических факторов на работу фотосинтетического аппарата растений.
3.3.3. Кинетика фотоиндуцированных окислительновосстановительных превращений реакционного центра Р0 в листьях С3 и С4растениЙ
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Определение ДрН затруднено тем, что прямое измерение внутри тилакоидов i электродами практически невозможно ввиду малости внутритилакоидного объма. Поэтому для измерения обычно используют специальные красители, спектры поглощения или флуоресценции которых чувствительны к окружающей среды Владимиров, Добрецов, . ДрН Ьо1кеша е а1. Поэтому разработка новых методов измерения ДрН в хлоропластах с помощью рНчувствительных спиновых меток является одной из наиболее актуальных задач биофизики фотосинтеза. Для этого в данной работе решались следующие практические задачи. Обоснование и разработка алгоритма измерения ДрН по фотоиндуцированным изменениям спектра ЭПР спиновой метки ТЕМРЛМШЕ. Разработка метода измерения ДрН в хлоропластах с помощью имидазолиновых меток. В ходе выполнения поставленных в данной работе задач возникла необходимость в создании программного обеспечения, позволяющего получать корректные разностные спектры ЭПР молекул спиновых меток, локализованных внутри тилакоидов, и проводить необходимую обработку получаемых спектров. Глава 1. Обзор литературы. Структурнофункциональная организация хлоропласта. Хлоропласта наряду с митохондриями и хроматофорами фотосинтезирующих бактерий относятся к энергопреобразующим органеллам клетки. Схематическое устройство хлоропласта приведено на рис. А. Хлоропласт имеет замкнутую двухслойную внешнюю мембрану, а также сложную систему замкнутых компартментов, образованных третьей мембраной, называемых тилакоидами. Внешнее по отношению к тилакоиду пространство хлоропласта называется стромой. Область, ограниченная тилакоидной мембраной, часто называется внутритилакоидным люменом. В хлоропластах протекает вся совокупность световых и темновых стадий фотосинтеза, который является фундаментальным биологическим процессом. В результате фотосинтеза происходит преобразование световой энергии в энергию химической связи макроэргических соединений , , которые используются для образования сахаров в реакциях цикла Кальвина. Процессы фотосинтеза принято разделять на две стадии световую и темновуто. Данное разделение имеет не только чисто классификационное значение. В некоторых видах растений толстянковые и растения с Сдтипом фотосинтеза данные стадии пространственно разделены и проходят в различных частях растения. ЫАОРН и синтез А ГР. Темповыми стадиями фотосинтеза называют совокупность биохимических реакций, в результате которых осуществляется синтез полисахаридов из углекислоты и воды с использованием энергии макроэргических соединений, накопленных на световых стадиях фотосинтеза. Углекислый газ усваивается растениями из атмосферного воздуха. В отличие от ферментов световых стадий фотосинтеза, которые локализованы в тилакоидной мембране, ферменты цикла Кальвина растворены в строме хлоропласта. ЗС Н 9А ТР 4 ИАОРН С6Я,6 8 9АИР 6АШР. Цепь электронного транспорта хлоропластов. Первичное разделение зарядов за счт световой энергии в реакционных центрах и дальнейшее движение элекгронов через различные ферментные комплексы электронтранспортной цепи описывается 2схемой фотосинтеза рис. Б. Рассмотрим кратко структурнофункциональную организацию цепи электронного транспорта хлоропластов. У высших растений и цианобактерий синезелные водоросли имеются две фотосистемы, совместное функционирование которых обеспечивает перенос электрона от воды, разлагаемой фотосистемой 2 ФС2, к конечному акцептору фотосистемы 1. Фотосистема 2. В самое последнее время появились данные о структурной организации комплекса ФС2, выделенного из БупесЬососсия еЬгаШБ Хойт е1 а. А рис. После поглощения кванта света антенным комплексом ФС2, включающим в себя нескольких сотен молекул пигмента, возбуждение мигрирует к фотореакциониому центру ФС2. Дрн АР
2Н
Рис. А.К. Кукушкин, А. Б. Схема нециклического электронного транспорта. Рис. Структура ФС2. Расположение трансмембранных аспиралей и кофакторов. Изображн целиком один из 2 мономеров обведн эллипсом. Точка зрения перпендикулярно тилакоидной мембране со стороны люмена. Ь Вид сбоку на реакционный центр ФС2.