Исследование стабильности и спонтанного сворачивания мутантных форм цитохрома С и рибосомного белка S6

• Автор: Латыпов, Рамиль Фаритович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Проблема сворачивания белка

1.2 Ранние стадии сворачивания белков

1.3 Поздние стадии сворачивания белков.

1.4 Равновесные промежуточные состояния

1.5 Роль упаковки шлрофобного ядра в определении

структурных и динамических свойств белков.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Список используемых сокращений и обозначений

2.2. Материалы.
2.3. Генноинженерные и биохимические методы
2.4. Физические методы исследования
2 А Л. Абсорбционная спектроскопия
2.4.2. Флуоресцентная спектроскопия.
2.4.3. Спектроскопия кругового дихроизма
2.4.4. Спектроскопия ЯМР высокого разрешения
2.4.5. Сканирующая микрокалориметрия
2.4.6. Кинетические методы
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3. РИБОСОМНЫЙ БЕЛОК М И ЕГО
ПЕРМУТИРОВАННЫЙ ВАРИАНТ
3.1. Получение белка и его пермутированного варианта
Теоретический дизайн пермутации белка .
Клонирование и секвенироваиие гена
Циркулярная пермутация гена .
Экспрессия белка дикого типа
и его пермутированного варианта
3.2. Сравнительное исследование структурных свойств белка Б
и его пермутированного варианта.
ГЛАВА 4. МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ ЦИТОХРОМА С.
4.1. Получение мутантных форм цитохрома с
Предпосылки данной работы и планируемые мутанты
Получение генноинженерной конструкции
дм экспрессии цитохрома с
Получение мутантных форм гена цитохрома с
Экспрессия мутантных форм цитохрома с
4.2. Равновесные исследования мутантных форм цитохрома с.
Флуоресцентные исследования
Исследования с помощью НЯМР высокого разрешения
Муяьтипараметрическое исследование.
Абсорбционные исследования
Структурная характеризация равновесного интермедиата
4.3.Кинетические исследования мугантных форм цитохрома с.
Полная кинетика сворачивания цитохрома с
фанаяиз мутации УУ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


В то же время, фундаментальный принцип Анфиисена . Есть и более специализированные вопросы. Например т. Сфуктуру белка Или, т. Левинталя Две основные гипотезы о том, как могут сворачиваться белки, были сформулированы еще в г. Гипотеза Болдуина предсказывала, что белки должны сворачиваться по механизму нуклеации и роста Тзот е1 а В соответствии с дайной гипотезой лимитирующим шагом в сворачивании белка является формирование ядра сворачивания, которое затем быстро растет, охватывая всю молекулу. Эта гипотеза подразумевает, что кинетика сворачивания белка протекает по принципу все или ничего каждая молекула белка скачком переходит згз развернутого состояния в свернутое, минуя какиелибо интермедиаты. Это также означает, что единственным состоянием, которое должно быть и может бьггь исследовано, является переходное состояние, т. О.Б. Птицын, напротив, постулировал в своей гипотезе Ршяуп е1 а1. Птицын, , что процесс самоорганизации белковой молекулы сопровождается формированием ряда лромежуточных состояний с последовательным возрастанием степени упорядоченности на первом этапе возникает вторичная структура, затем приблизительное взаимное расположение аспиралей и Ртяжей и, наконец, третичная структура на атомном уровне. Эга гипотеза подразумеваем что лимитирующей стадией сворачивания является скорее конец, чем начало данного процесса. За несколько лет до появления этих гипотез с целью разрешения парадокса Левинталя было выдвинуто предположение о существовании специфического пути сворачивания, т. vi, . Очевидно, что если путь сворачивания будет достаточно специфичен, то белковой молекуле не потребуется перебирать все возможные конформации, следовательно, парадокс Левинталя будет преодолен. И действительно многочисленные экспериментальные работы доказывают накопление частично свернутых промежуточных состояний как в ходе сворачивания белков, так и в умеренно денатурирующих условиях . Однако, в ходе более поздних исследований были обнаружены и белки, сворачивающиеся без интермедиатов. Так, в г. Джексон и Фершт показали, что кинетика сворачивания химотрнпсинового ингибитора 2 I2 маленького белка, состоящего из остатков соответствует кинетике процесса типа все или ничего, протекающего без накопления какихлибо кинетических интермедиатов . Позже подобный характер сворачивания был описан для ряда других маленьких белков , vi. Проблема синтеза этих двух, казалось бы. Однако, предпосылки для этого уже имеются. Так, гипотеза о наличии определенного пути сворачивания теперь дополняется представлениями о молекулярных ансамблях и энергетических ландшафтах или даже сменяется представлениями о так называемых воронках сворачивания i . В последнем случае сворачивание выглядит, как стекание воды струйками по горному склону со сложным рельефом, а не как поток через один единственный водосток i . Т.с. С этой точки зрения накапливающиеся промежуточные состояния скорее лишь отражают свойства энергетической поверхности, нежели являются необходимыми для сворачивания белка. Эти подходы потенциально могли бы объяснить, почему в случае одних белков сворачивание происходит без накопления промежуточных состояний, а в случае других с накоплением. Экспериментальное исследование энергетической поверхности сворачивания белка требует летальной характеризации всех промежуточных состояний с целью определения важности различных взаимодействий в белке в направлении процесса сворачивания. Вследствие сложности этой задачи известные к настоящему моменту энергетические ландшафты являются результатом лишь теоретических расчетов на простых моделях. Наиболее общий подход к исследованию кинетики белкового сворачивания основывается на использовании устройств быстрого смешивания, которые позволяют инициировать сворачивание белка благодаря скачкообразному изменению состава растворителя. Предварительное разворачивание белка достигается денатурирующими условиями, т.