Прооксидантное и цитотоксическое действие тиолов в комбинации с витаминами B126 на опухолевые клетки in vitro

• Автор: Фасхутдинова, Алсу Амировна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Окислительный стресс

1.2. Виды клеточной гибели при окислительном стрессе

1.3 Окислительный стресс как индуктор апоптоза

1.4. Антиоксиданты и прооксиданты.

1.5. Значение ионов металлов с переменой валентностью в образовании и метаболизме АФК.
1.6. Бинарные каталитические системы генерации АФК на основе сочетаний АО и металлов переменной валентности

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Клеточные культуры.

2.3. Оценка цитотоксичности.
2.4. Морфологический люминесцентный анализ апоптоза.
2.5. Анализ апоптоза методом проточной цитометрии.
2.6. ДНК электрофорез межнуклеосомная фрагментация
2.7. Оценка каспазной активности
2.8. Анализ содержания перекиси в среде с помощью кислородного электрода.
2.9 Анализ генерации гидроксильных радикалов
2. Оценка внутриклеточной окислительной активности
2. Анализ однонитевых разрывов ДНК комета тест
2. Определение мембранного потенциала митохондрий.
2. Выход цитохрома с из митохондрийИммуноблоттинг
2. Определение стабильности лизосомальных мембран.
2. Анализ перекисей липидов клеточных мембран.
2. Статистический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Синергизм цитотоксического эффекта тиолов в сочетаниях с витамином Вьна опухолевые клетки i vi
а Ингибирование пролиферации и гибель клеток НЕр2, и ЗТЗ в зависимости от концентрации тиолов при их раздельном и сочетанном применении с витамином В2Ь.
б Изучение кинетики клеточной гибели, индуцированной сочетаниями тиолов с витамином В ь.
в Зависимость цитотоксического действия тиолов в сочетании с витамином i2 от посевной концентрации клеток НЕр2.
г Зависимость гибели клеток под действием тиолов в сочетании с витамином 2 от времени инкубации
3.2. Изучение типа гибели клеток, индуцируемой действием витамина 2 в сочетании с тиолами.
а Морфологичский анализ апоптоза. Увеличение доли апоптотических и погибших клеток.
б Оценка апоптоза по присутствию частиц в субi области на ДНК цитограммах
в Межнуклеосомная фрагментация ДНК
г Определение активности каспазы
3.3. Исследование прооксидантного эффекта сочетаний тиолов с витамином В2ь и установление роли активных форм кислорода в цитотоксическом действии этих сочетаний
а Генерация Н2 в ростовой среде тиолами в сочетании с витамином В2ь.
б Генерация гидроксил радикала
в Внутриклеточная окислительная активность.
г Влияние нетиоловых антиоксидантов на цитотоксическое действие тиолов в сочетании с витамином Вь
3.4. Выяснение механизма клеточной гибели сочетаниями тиолов с В2ь
а Действие хелаторов железа
бКинетика накопления однонитевых разрывов и щелочнолабильиых сайтов ДНК.
в Оценка состояния митохондрий.
г Дестабилизация лизосом.
д Оценка гидроперекисей липидов
ОБСУЖДЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ОБНвосстановленный глутатион
ЫАСЫацетилцистеин
ЭТТдитиотрейтол
АФКактивные формы кислорода
ОСокислительный стресс
СОДсупероксидцисмутаза
ГПглутатионпероксидаза
ПАРПполи А Д Фри бозап ол и м ераза
ПОЛперекисное окисление липидов
АОантиоксиданты
СРОсвободнорадикальное окисление
ФРферритин
Т фтрансферрин
ТфРтрансферриновый рецептор
АКЬаскорбиновая кислота
БКСбинарная каталитическая система
ТФтерафтал
ЕВгзтидиум бромид
ОРОдефероксамин мезилат
РТЕфенантролин
ЫСнсокупроин
ОС 1РОА2,7дихлородигидрофлуоресцеин диацетат СССкумарин3 карбоновая кислота РВБфосфагный буфер БОБдодецилсульфат натрия ДЧтмитохоидриальный потенциал
ВВЕДЕНИЕ


Синергизм цитотоксического действия тиолов в сочетании с витамином В ь выявляется при таких концентрациях веществ, при которых они в отдельности нетоксичны. Установлено, что цитотоксическое действие системы тиолВь обусловлено генерацией и накоплениием перекиси водорода во внеклеточной среде, что вызывает внутриклеточный окислительный стресс и повреждение окислительновосстановительной системы клеток. Обнаружено, что система тиолВь оказывает генотоксическое действие на опухолевые клетки и индуцирует апоптоз в клетках НЕр2, НЬ и МН ЗТЗ. Установлено, что гибель клеток осуществляется при участии внутриклеточного железа. Обнаружено, что ранними событиями в клетках в результате повреждающего действия тиолов в сочетании с витамином В2ь являются дестабилизация лизосом, одионитевыс разрывы ДИК и перекисное окисление липидов клеточных мембран. Практическая ценность работы. Данное исследование представляет практический интерес для онкологии и фармакологии, а также для корректного использования витаминных и антиоксидантных препаратов в медицине. Работа вносит вклад в развитие представлений о молекулярных и клеточных механизмах цитотоксического действия новых прооксидантных систем. Окислительный стресс. В живых организмах в процессе биологического окисления постоянно образуются различные активные формы кислорода АФК. АФК могут образовываться У в ходе нормальных внутриклеточных метаболических процессов, 2 в ходе осуществления специализированных клеточных функций, 3 за счет смещения равновесия процессов окислительно
восстановительного метаболизма при стрессе и определенных патологических состояниях, 4 а также за счет внешних воздействий на клетки, таких как контакт с ксенобиотиками, различных видов излучений и других форм стресса Еропкин и Еропкина, i, Владимиров с соавт. Кокряков, . Избыточная продукция АФК или нарушения нормального функционирования систем аптиоксидантной защиты вызывают усиленное окислительное повреждение биомолекул, что приводит к развитию дисфункции клеток и тканей организма в результате окислительного стресса ОС , i, i, , . Под окислительным стрессом понимают сдвиг равновесия про и антиоксидантных систем в пользу первых, ведущий к потенциальному повреждению тканей и органов, вследствие избыточного уровня в них радикалов кислорода. Системы, участвующие в образовании АФК, в окислении биологических соединений, условно объединены понятием прооксидантная система Залесский, Великая, . Токсическое действие АФК проявляется при состояниях ОС, которые сопровождается резкой интенсификацией свободнорадикальных процессов в тканях. Механизм генерации АФК при многих патологических состояниях носит общий характер. Именно интенсификация этих процессов является основной причиной цитотоксического поражения тканей Залесский, Великая, . Основным источником активных форм кислорода в живой клетке являются оксидоредуктазы, в процессе функционирования образующие некоторое количество и Н2, процессы автоокисления некоторых веществ например, катехоламинов и митохондрии . В физиологических условиях и Н2 мстаболизируются СОД и ГП, в результате их концентрация поддерживается на низких уровнях около Юп М для и 9 М для Н2 , , . АФК можно разделить на несколько больших групп радикалы кислорода, радикалообразующие молекулы и ионы, радикалы антиоксидантов и др. Табл. Радикалы и ионы кислородных интермедиатов чрезвычайно нестабильны и реактивны. Так, время жизни и ОН составляет приблизительно Юб и 9с соответственно. Изза большой реактивности и малого времени жизни обычно рассматривается их действие только лишь на те мишени, в непосредственной близости, от которых они образованы , . В отличие от них Н2 стабильная молекула, которая может свободно диффундировать через клеточные мембраны. Полупероиод существования Н2 при С составляет 0с. В отсутствие восстановителей перекись водорода довольно стабильна и вследствие своей незаряженной ковалентной структуры может легко проникать через плазматическую мембрану клетки и мембраны внутриклеточных органелл. Н2 в концентрациях 0,,5 мМ вызывает однонитевые разрывы ДНК, индуцирует диссоциацию железа из ферритина . Якутова с соавт.