Изучение взаимодействия токсинов яда кобры Naja oxiana с мембранами методом ЯМР спектроскопии

• Автор: Лесовой, Дмитрий Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Оглавление

Список использованных сокращений

1 Введение

1.1 Актуальность темы исследований.

1.2 Цель и задачи исследования.

1.3 Научная новизна работы

1.4 Научная и практическая ценность.

1.5 Выбор темы литературного обзора.

2 РЯМР спектроскопия широких линий в исследовании липидбелковых взаимодействий обзор литературы.

2.1 Область применения методики

2.1.1 Возможности метода в определении характера упаковки липидов.

2.1.1.1 Детектирование фазового состояния бислоя
2.1.1.2 Действие белков на бислой возмущения в структуре бислоя.
2.1.1.3 Исследования небислойных упаковок липидов.
2.1.2 Используемые мембранные системы.
2.1.2.1 Реконструированные мембраны.
2.1.2.2 Биологические мембраны
2.2 Теоретические аспекты 3,РЯМР фосфолипидов.
2.3 Примеры применения РЯМР спектроскопии в исследованиях липидбелковых взаимодействий
2.4 Анализ и обработка РЯМР спектров модельных
фосфолипидных мембран
2.4.1 Методики обработки РЯМР спектров фосфолипидных дисперсий.
2.4.1.1 Метод Первого спектрального момента.
2.4.1.2 Депакинг
2.4.1.3 Аппроксимация экспериментального спектра теоретическим
2.4.2 Возможности доступных программ для анализа формы линии мРЯМР спектров
3 Материалы и методы
3.1 Использованные препараты и способы приготовления образцов
3.2 Получение и анализ ЯМР спектров
3.3 Использованные методики молекулярного моделирования
3.4 Расчт электростатических и гидрофобных свойств молекул токсинов .
3.5 Измерение активности нейротоксина II.
4 Результаты и обсуждения.
4.1 Связывание токсинов с мембранами. НЯМР спектроскопия.
4.2 Влияние связывания токсинов на состояние мембраны РЯМР спектроскопия.
4.2.1 Формирование изотропной фазы.
4.2.2 Влияние токсинов на анизотропию химического сдвига фосфолипидов
4.2.3 Влияние токсинов на эластичность фосфолипидного бислоя.
4.3 Топология взаимодействия II с фосфолипидным бислоем.
4.3.1 Влияние аминокислотных замен на расположение молекулы II на мембране.
4.4 Электростатические свойства молекул токсинов
4.5 Детализация топологии взаимодействия токсинов с мембраной.
4.5 Распределение полярных и гидрофобных свойств на доступной поверхности токсинов
4.6 Взаимодействие трхпетельных токсинов с липидной мембраной комбинированное рассмотрение.
4.6.1 Биологическая роль мембраносвязанного состояния токсинов
4.7 Заключение.
4.8 Выводы
Благодарности
Список литературы


Среди мембранных белков хорошо известны такие структурные мотивы как трансмембранные и периферические аспирали, Рбочонки. В последнее время в качестве источника новых структурных мотивов, обеспечивающих связывание с мембранами, исследуются рскладчатые полипептиды, в частности, токсины из яда змей. Яд кобры xi содержит как цитотоксины так и нейротоксины, обладающие общим структурным мотивом Рис. Суммарное содержание этих токсинов в сухом яде составляет около 3 . Токсины являются небольшими аминокислотных остатков основными белками, так как они содержат 9 положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Они характеризуются трхпетельной укладкой полипептидной цепи, формируемой тяжами антипараллельной структуры, стабилизированной 4мя дисульфидными связями Рис. Хотя аминокислотные последовательности и структурный мотив цитотоксинов и нейротоксинов гомологичны, спектры их биологической активности существенно отличаются 8. Цитотоксины проявляют гемолитическую и цитотоксическую активности, способны приводить к деполяризации мембран миофибрилл 8, , . Некоторые цитотоксины проявляют кардиотоксическую активность при малых концентрациях, приводя к увеличению частоты сердцебиения, а при больших концентрациях могут вызывать остановку сердца . Исследуются токсические эффекты цитотоксинов на клетки опухоли . Предполагается, что различие в цитотоксической активности молекул связано не с деталями вторичной структуры белков, а со спецификой взаимодействия боковых цепей аминокислотных остатков с липидами , так как было показано, что структура молекул цитотоксинов сохраняется при встраивании в липидное окружение 5, . Связывание цитотоксинов с фосфолипидами определяет их способность приводить к лизису различных клеток 8, , , . Предполагается, что эти эффекты обусловлены способностью цитотоксинов взаимодействовать с липидами и биологическими мембранами посредством комбинации как электростатических так и гидрофобных сил . В экспериментах с модельными липидными мембранами показано, что цитотоксины приводят к слиянию фосфолипидных везикул , изменению термотропных характеристик фосфолипидных мембран , индуцируют фазовое разделение в смесях анионных и цвиттерионных фосфолипидов . Данные исследования привели к делению цитотоксинов Рис. Р и 8типы, которые различаются присутствием аминокислотных остатков пролина или серина в окончании второй петли . Тем не менее вс ещ отсутствует понимание связи между способами взаимодействия цитотоксинов с липидами и функцией цитотоксинов в биомембране. Для прояснения этой связи было изучено связывание цитотоксинов СТО и СТ1 с фосфолипидами, исследовано влияние цитотоксинов на упаковку фосфолипидов в составе модельных мембран. Рис. Ленточные представления структуры II , I б и II в молекул токсинов. Жлтым цветом показаны дисульфидные связи структуры взяты из банка код 1СВ9 для СП1, 15 для I и 1 для II. Для получения более полной информации о взаимодействии трехпетельных токсинов с липидными мембранами важно рассмотреть структурно сходные с цитотоксинами белки, отличающиеся по гидрофобным свойствам и заряду. Как было сказано выше II Рис. Нейротоксины из яда кобр являются высокоэффективными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора , . Мембранная же активность нейротоксинов, в отличие от цитотоксинов, изучена крайне слабо, хотя предполагается, что и для нейротоксинов мембраносвязанное состояние играет важную роль при взаимодействии с нАХР , . Поэтому представляет интерес детально исследовать взаимодействие нейротоксинов с мембранами и, таким образом, получить информацию о мембраноактивном сайте молекулы нейротоксина и его кооперативное с сайтом, блокирующем нАХР. При исследовании липидбелковых взаимодействий важно получить структурнодинамическую информацию как о белке в связанном с мембраной состоянии, так и о характеристиках самой липидной мембраны особенно их изменениях вследствие взаимодействия с белком.